一种萃取含疏水基的水溶性有机化合物的方法，包括以下步骤：使包含含疏水基的水溶性有机化合物和糖的水溶液与极性有机溶剂接触，获得水相与有机相，由此使含疏水基的水溶性有机化合物转入有机相中。水溶液的糖浓度可以是每100ml水溶液至少12g糖。该水溶液还可以包含相分离助剂。相分离助剂选自氯化钠、柠檬酸钠、硫酸镁和硫酸铵。

　　1： 一种萃取含疏水基的水溶性有机化合物的方法，其包括以下步 骤： 使包含含疏水基的水溶性有机化合物和糖的水溶液与极性有机溶 剂相接触，得到水相和有机相，由此使含疏水基的水溶性有机化合物 转入有机相。

　　2： 权利要求1的方法，其中水溶液的糖浓度为每100ml水溶液 至少12g糖。

　　3： 权利要求1的方法，其中含疏水基的水溶性有机化合物是水溶 性芳族化合物。

　　4： 权利要求1的方法，其中含疏水基的水溶性有机化合物选自苯 酚衍生物及其苷。

　　5： 权利要求1的方法，其中含疏水基的水溶性有机化合物选自氢 醌苷、儿茶素、水杨苷、橙皮苷、橙皮苷基糖苷、咖啡酸、水杨醇和 鞣花单宁。

　　8： 权利要求6的方法，其中相分离助剂选自氯化钠、柠檬酸钠、 硫酸镁和硫酸铵。

　　10： 权利要求6的方法，其中极性有机溶剂是四氢呋喃、乙腈、 丙酮或异丙醇。

　　11： 权利要求1的方法，其中含疏水基的水溶性有机化合物源自 酶反应溶液。

　　13： 权利要求12的方法，其中糖基化反应溶液是橙皮苷或氢醌的 糖基化反应溶液。

　　14： 权利要求1的方法，其中含疏水基的水溶性有机化合物源自 于选自动物或植物的有机体。

　　16： 权利要求1的方法，其中水溶液通过浓缩包含含疏水基的水 溶性有机化合物和糖的酶反应溶液而制备。

　　18： 权利要求17的方法，其中糖基化反应溶液是橙皮苷或氢醌的 糖基化反应溶液。

　　19： 权利要求1的方法，其中水溶液通过浓缩或稀释有机体的萃 取物来制备，其中该萃取物包含含疏水基的水溶性有机化合物和糖， 并且该有机体是动物或植物。

　　21： 权利要求6的方法，其中水溶液通过将相分离助剂加入包含 含疏水基的水溶性有机化合物和糖的酶反应溶液或其浓缩液来制备。

　　23： 权利要求22的方法，其中糖基化反应溶液是橙皮苷或氢醌的 糖基化反应溶液。

　　24： 权利要求6的方法，其中水溶液通过将相分离助剂加入有机 体的萃取物、其浓缩物或其稀释液中来制备，其中该萃取物包含含疏 水基的水溶性有机化合物和糖，并且该有机体是动物或植物。

　　25： 权利要求6的方法，其中水溶液通过将相分离助剂加入果汁 或其浓缩液中来制备。

　　26： 一种提纯苯酚衍生物苷的方法，其包括以下步骤： 将包含苯酚衍生物、苯酚衍生物苷和糖的第一水溶液与极性有机 溶剂相接触，得到第一水相和包含少量水的有机相，由此使苯酚衍生 物和苯酚衍生物苷转入有机相； 回收包含少量水的有机相； 从包含少量水的有机相中除去极性有机溶剂，得到包含苯酚衍生 物和苯酚衍生物苷的第二水溶液； 使第二水溶液与乙酸乙酯接触，获得第二水相和乙酸乙酯相，由 此使苯酚衍生物转入乙酸乙酯相中； 回收第二水相；和 将第二水相浓缩并冷却，以便沉淀苯酚衍生物苷。

　　27： 权利要求26的方法，其中苯酚衍生物和苯酚衍生物苷源自苯 酚衍生物糖基化反应溶液。

　　28： 权利要求27的方法，其中糖基化反应溶液是橙皮苷或氢醌的 糖基化反应溶液。

　　30： 权利要求29的方法，其中糖基化反应溶液是橙皮苷或氢醌的 糖基化反应溶液。

　　本发明涉及用于从包含含疏水基的水溶性有机化合物(例如源自动物或植物的萃取物以及酶反应溶液)的水溶液中高纯度和高产率地萃取含疏水基的水溶性有机化合物的方法。

　　已知许多具有各种生理活性的天然化合物，以粗制药物萃取物为代表。这些天然化合物也被称为生理活性物质。通常通过下述方法提纯各种生理活性物质，使用包含该生理活性物质的材料和水、温水或低浓度含水醇溶液进行萃取以获得萃取溶液，浓缩该萃取溶液，然后将浓缩的萃取溶液进行柱色谱分离。然而，这种提纯方法需要大的柱和与此相匹配的设备，以便得到大量生理活性物质。小柱的效率很低。因此，提纯的生理活性物质非常昂贵。

　　对于通过溶剂萃取法提纯生理活性物质，人们已进行了各种尝试。但是，由于安全问题不能将下述方法用于食物，即向水溶液中加入原本与水不混溶的有机溶剂如乙酸乙酯、丁醇和氯仿，搅拌，并使溶液静置以获得两相即水相和有机溶剂相，然后回收转入有机溶剂相的生理活性物质。甚至在将生理活性物质用于除食物以外的用途时，使用有机溶剂也不能有效萃取一些生理活性物质，因为生理活性物质不能大量转入有机溶剂相。因为能用于食物的一些有机溶剂如乙醇和丙酮是与水混溶的，这些有机溶剂不能用于从水溶液中萃取和提纯生理活性物质。

　　另一方面，类黄酮如橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷和芸香苷微溶于水中。为了克服这一障碍，即溶解度差，人们已经进行了各种尝试来有效溶解这些难溶性化合物。例如，已经公开了通过酶催糖基化作用提高类黄酮如橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷和芸香苷的溶解度的方法(日本公开专利7-107972)。

　　也公开了出于同一目的通过酶催糖基化作用提高除上述类黄酮以外的儿茶素、咖啡酸、曲酸、氢醌、儿茶酚、间苯二酚、原儿茶酸、五倍子酸、香草醛、黄豆苷原、染料木素、α-间二羟苯甲酸和间苯三酚的溶解度的方法(日本专利公告7-36758和T.Nishimura，J.Ferment.Bioeng.，78(1994)37页)。

　　但是，因为苷本身的水溶性被提高，所以苷不能被有效萃取到与水不混溶的溶剂中。而且，由于安全问题，为从进行了糖基化作用的酶反应溶液中提纯苷需要使用柱色谱法如吸附色谱法。

　　在常规提纯方法中，为了从天然材料中获得部分提纯的类黄酮、儿茶素、苯酚及它们的苷，采用了使用天然材料和碱性水溶液、有机溶剂、热水等来进行萃取，然后通过柱色谱法提纯萃取溶液的方法。但是，为了高产率低成本地获得大量这些物质，萃取和提纯需要使用能用于食物的安全有机溶剂。但是，因为可用于食物的丙酮可与水混溶，所以不可能使用丙酮来萃取这些物质。大多数可有效用于食物和药物领域的生理活性物质具有如下性质，即它们易溶于高极性溶剂如水、乙醇和丙酮，而难溶于低极性溶剂，因此它们不能被有效地从低极性溶剂中萃取出来。

　　作为深入研究的结果，本发明人发现，即使在使用本质上难以和水相(其中有机溶剂与水或热水混合)分离的有机溶剂时，如果包含生理活性物质的水溶液中存在具有保水能力的物质如糖类，则有可能在混合并搅拌水溶液和有机溶剂后很容易地从有机相分离水相。本发明人也发现生理活性物质转入到有机相中。此外，本发明人发现，通过加入盐(例如氯化钠和柠檬酸钠)或有机酸来增加水溶液的离子强度，即使存在糖类，不与水相分离的有机溶剂或难以与水相分离的有机溶剂也可以从水相中分离出来，生理活性物质也可以有效地转入有机溶剂相中。基于这些发现，本发明人完成了本发明。

　　本发明方法是萃取含疏水基的水溶性有机化合物的方法，包括以下步骤：使包含含疏水基的水溶性有机化合物和糖类的水溶液与极性有机溶剂接触，获得水相与有机相，由此使含疏水基的水溶性有机化合物转入有机相中。

　　在一个实施方案中，该水溶液的糖类浓度可以是每100ml水溶液至少12g糖类。

　　在一个实施方案中，含疏水基的水溶性有机化合物可以选自氢醌苷、儿茶素、水杨苷、橙皮苷、橙皮苷基糖苷(hesperidinglycosides)、咖啡酸、水杨醇和鞣花单宁(elladitannin)。

　　在一个实施方案中，含疏水基的水溶性有机化合物可以源自选自动物或植物的有机体。

　　在一个实施方案中，水溶液可以通过浓缩包含含疏水基的水溶性有机化合物和糖类的酶反应溶液来制备。

　　在一个实施方案中，水溶液可以通过浓缩或稀释有机体的萃取物来制备，其中萃取物包含含疏水基的水溶性有机化合物和糖类，有机体是动物或植物。

　　在一个实施方案中，水溶液可以通过将相分离助剂加入包含含疏水基的水溶性有机化合物和糖类的酶反应溶液或其浓缩物中来制备。

　　在一个实施方案中，水溶液可以通过将相分离助剂加入有机体的萃取物、其浓缩物或其稀释液中来制备，其中该萃取物包含含疏水基的水溶性有机化合物和糖类，该有机体是动物或植物。

　　在一个实施方案中，水溶液可以通过将相分离助剂加入果汁或其浓缩物中来制备。

　　本发明的提纯方法是提纯苯酚衍生物苷的方法，包括以下步骤：首先将包含苯酚衍生物、苯酚衍生物苷和糖类的第一水溶液与极性有机溶剂接触，获得第一水相和包含少量水的有机相，由此苯酚衍生物和苯酚衍生物苷转入有机相中；回收包含少量水的有机相；从包含少量水的有机相中除去极性有机溶剂，获得包含苯酚衍生物和苯酚衍生物苷的第二水溶液；将第二水溶液与乙酸乙酯接触，获得第二水相和乙酸乙酯相，由此苯酚衍生物转入乙酸乙酯相中；回收第二水相；浓缩和冷却第二水相以沉淀苯酚衍生物苷。

　　在一个实施方案中，苯酚衍生物和苯酚衍生物苷可以源自苯酚衍生物糖基化反应溶液。

　　在下文中将详细描述本发明。除非另有说明，本文所用的浓度表示为每100立方厘米溶液中的克数。例如，“10％氯化钠溶液”是指每100立方厘米溶液溶解10g氯化钠的氯化钠溶液。

　　本发明方法是萃取含疏水基的水溶性有机化合物的方法。该方法包括以下步骤：使包含含疏水基的水溶性有机化合物和糖类的水溶液与极性有机溶剂接触，获得水相和有机相，使含疏水基的水溶性有机化合物转入有机相中。

　　本文所用的“含疏水基的水溶性有机化合物”是指包含疏水基并且可溶于水的有机化合物。

　　本文所用的“水溶性”化合物是指在20℃下1升水可以溶解至少0.01g的化合物。在20℃下，优选至少0.1g，更优选至少1g，更优选至少5g，最优选至少10g含疏水基的水溶性有机化合物可以溶于1升水中。对于溶解度没有特别的上限，虽然溶解度优选为在20℃下1升水溶解不超过300g。更优选溶解度是，在20℃下1升水溶解不超过100g。

　　疏水基优选包含至少三个碳原子，更优选包含芳族残基的疏水基。含疏水基的水溶性有机化合物的例子包括类黄酮、异黄酮、酚类化合物、类黄酮苷、异黄酮苷、酚类化合物苷、氢醌苷、蒽苷、水溶性芳族化合物(例如查耳酮苷)、萜烯苷、甾类糖苷、三萜类苷、生物碱苷和C-苷。优选含疏水基的水溶性有机化合物是水溶性芳族化合物。

　　“苯酚衍生物”是指具有苯酚骨架(即苯环)或类黄酮骨架，并且具有连接到苯酚骨架或类黄酮骨架的羟基的化合物，包括苯酚和曲酸。苯酚衍生物的例子包括在单个苯酚或类黄酮骨架上具有酚羟基的化合物，以及在单个苯酚或类黄酮骨架上具有至少两个酚羟基的化合物。在下文中，为了方便起见，在单个苯酚或类黄酮骨架上具有一个酚羟基的化合物称为单酚型化合物，在单个苯酚或类黄酮骨架上具有至少两个酚羟基的化合物称为多酚型化合物。

　　在单个苯酚或类黄酮骨架上具有一个酚羟基的单酚型化合物的例子包括苯酚、水杨醇、曲酸、二甲氧基苯酚、扑热息痛、香草醛和黄豆苷。

　　单酚化合物的例子也包括单酚型类黄酮型化合物。单酚型类黄酮型化合物的例子包括单酚型黄酮型化合物、单酚型异黄酮型化合物、单酚型黄酮醇型化合物、单酚型黄烷酮型化合物、单酚型二氢黄酮醇型化合物、单酚型儿茶素型化合物、单酚型嗅哢型化合物、单酚型查耳酮型化合物和单酚型二氢查耳酮型化合物。

　　二甲氧基苯酚的例子包括2，3-二甲氧基苯酚、2，4-二甲氧基苯酚、2，5-二甲氧基苯酚、2，6-二甲氧基苯酚、3，4-二甲氧基苯酚和3，5-二甲氧基苯酚。优选3，4-二甲氧基苯酚和3，5-二甲氧基苯酚。

　　在单个苯酚或类黄酮骨架上具有至少两个酚羟基的多酚型化合物的例子包括氢醌、橙皮素、表焙儿茶素、表儿茶精没食子酸盐、花色素型化合物、花色苷型化合物、咖啡酸、儿茶酚、间苯二酚、原儿茶酸、五倍子酸、染料木素、β-间二羟苯甲酸和间苯三酚。

　　双酚化合物的例子也包括双酚型类黄酮型化合物。双酚型类黄酮型化合物的例子包括双酚型黄酮型化合物、双酚型异黄酮型化合物、双酚型黄酮醇型化合物、双酚型黄烷酮型化合物、双酚型二氢黄酮醇型化合物、双酚型儿茶素型化合物、双酚型嗅哢型化合物、双酚型查耳酮型化合物和双酚型二氢查耳酮型化合物。

　　间二羟苯甲酸的例子包括α-间二羟苯甲酸、β-间二羟苯甲酸和γ-间二羟苯甲酸。在本发明中，优选β-间二羟苯甲酸。

　　本文所用的“苯酚衍生物苷”是其中苯酚衍生物部分通过苷键与一个或多个糖类部分连接的物质。苯酚衍生物苷可以是单吡喃葡萄糖苷(例如氢醌-O-α-D-吡喃葡萄糖苷、水杨苷、咖啡酸-O-α-D-吡喃葡萄糖苷、3，4-二甲氧基苯酚-O-α-D-吡喃葡萄糖苷和儿茶素-O-α-D-吡喃葡萄糖苷)、其中糖类部分再与上述单吡喃葡萄糖苷连接的二吡喃葡萄糖苷(例如橙皮苷衍生物)、三吡喃葡萄糖苷等。

　　本文所用的“苷”是其中糖苷配基通过苷键与一个或多个糖类部分连接的物质。糖类部分的聚合度优选1-10，更优选1-5，更加优选1-3。糖类部分可以是单糖部分或二糖部分。本文所用的葡糖苷包括在苷的定义内。葡糖苷是一个或多个葡萄糖部分连接到糖苷配基上的苷。

　　含疏水基的水溶性有机化合物优选选自水杨苷、松柏苷、熊果苷、番泻叶苷、甜菊苷、rubsoside、芸香苷、橙皮苷、柚皮苷、黄豆苷、染料木苷、barbaroin、香草醛、皂草苷、黄连素、堪非醇、黄芩苷、茵陈素儿茶素、延胡索碱、七叶苷原、表儿茶精、姜辣素、甘草甜素、洋芫荽甙、新橙皮苷、咖啡酸、水杨醇、鞣花单宁和氢醌。含疏水基的水溶性有机化合物更优选选自氢醌苷、儿茶素、水杨苷、橙皮苷、橙皮苷基糖苷、咖啡酸、水杨醇和鞣花丹宁。

　　含疏水基的水溶性有机化合物可以以任何浓度存在于水溶液中。含疏水基的水溶性有机化合物的浓度优选0.01-50％，更优选0.1-40％，更加优选0.5-30％，还更加优选1-20％，最优选5-15％。如果存在于水溶液中的含疏水基的水溶性有机化合物的浓度过低，则提纯效率可能低。如果存在于水溶液中的含疏水基的水溶性有机化合物的浓度过高，则含疏水基的水溶性有机化合物可能发生沉淀。优选的是含疏水基的水溶性有机化合物不发生沉淀的浓度。

　　含疏水基的水溶性有机化合物可源自包含该含疏水基的水溶性有机化合物的酶反应溶液。本文所用的酶反应溶液是指使所有原料都进行酶反应所获得的溶液。这样的酶反应溶液的例子包括含疏水基的水溶性有机化合物的糖基化反应溶液、水解反应溶液、转移反应和缩合反应溶液。酶反应溶液优选包含糖。酶反应溶液一般是反应已经进行并且反应产物已经制成后的反应溶液。

　　糖基化反应的典型例子是用于糖基转移受体的糖基转移反应，其通过环糊精葡聚糖转移酶催化。这种糖基转移受体的例子包括在结构中包含糖的类黄酮、在结构中不包含糖的类黄酮、苯酚化合物和酚类化合物苷。典型糖基转移受体的例子包括橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷和芸香苷。

　　糖基化反应的另一个例子是用于糖基转移受体的糖基转移反应，其通过转移型(transferring type)淀粉酶催化。这种糖基转移受体的例子包括儿茶素、咖啡酸、曲酸、氢醌、儿茶酚、间苯二酚、原儿茶酸、五倍子酸、香草醛、黄豆苷、染料木素、α-间二羟苯甲酸和间苯三酚。

　　催化酶反应的酶的例子除了环糊精葡聚糖转移酶和转移型淀粉酶之外包括：α-淀粉酶、支链淀粉酶、麦芽糖转葡糖基酶、D-酶、新支链淀粉酶(neopullulanase)、环糊精酶、α-葡糖苷酶、纤维素酶、β-葡糖苷酶和β-半乳糖苷酶。

　　包含含疏水基的水溶性有机化合物的酶反应溶液可以通过本领域技术人员公知的方法设计和获得。

　　含疏水基的水溶性有机化合物也可源自包含该含疏水基的水溶性有机化合物的任何天然材料。例如，含疏水基的水溶性有机化合物可以源自有机体(例如动物或植物)。或者，可以使用动物萃取物或植物萃取物。动物萃取物是指从动物萃取的任何物质。植物萃取物是指从植物中萃取的任何物质。例如，可以使用从植物叶、茎、根、花、果实等中获得的任何含疏水基的水溶性有机化合物。植物材料的例子包括大豆、加工的大豆制品、海参、五倍子、黄芩(ScutellariaRadix)、芦荟、地黄(Rehmannia Radix)、人参(Panax ginseng)、芍药(Paeoniae Radix)、栀子、甘草(Glycyrrhizae Radix)、柴胡(Bupleuri Radix)、大黄(Rhei rhizome)、蕺菜、越橘(Vacciniumvitis-idaea)、茶、Sweet tea(中国黑莓茶；Rubus suanissm S.Lee)和柑桔(例如橘子的果实)。可以使用存在于动物体中的任何含疏水基的水溶性有机化合物。

　　本文所用的糖是指满足通式Cn(H2O)m的化合物。糖根据组分即糖单元的数目分为单糖、寡糖和多糖。在本发明中，优选单糖和寡糖。在本发明中，优选可溶于水的，或者如果不溶于水但具有保水能力的糖。

　　单糖的例子包括D-葡萄糖、半乳糖、果糖、阿糖、木糖和鼠李糖。优选的单糖是D-葡萄糖。

　　本文所用的寡糖是指通过2-10个单糖进行脱水缩合获得的物质。寡糖优选具有2-9个糖单元，更优选2-8个糖单元，甚至更优选2-7个糖单元。寡糖的例子包括蔗糖、乳糖、麦芽糖寡糖(malto-oligosaccharides)、半乳糖寡糖(galacto-oligosaccharides)、乳糖寡糖(lacto-oligosaccharides)和果糖寡糖(fructo-oligosaccharides)。麦芽糖寡糖的例子包括麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、麦芽八糖、麦芽九糖和麦芽十糖。寡糖可以是直链寡糖或者支链寡糖。寡糖可以具有分子内环结构。

　　本文所用的多糖是指通过至少11个单糖进行脱水缩合产生的物质。多糖优选具有至少一个α-1，4键。多糖的例子包括糊精、直链淀粉、支链淀粉、淀粉、右旋糖酐和纤维素。

　　直链淀粉是由通过α-1，4键连接的葡萄糖单元组成的直链分子。直链淀粉包含在天然淀粉中。

　　支链淀粉是由通过α-1，4键连接在一起的葡萄糖单元组成的支链分子，所述葡萄糖单元上还连接有通过α-1，6键连接的葡萄糖单元。支链淀粉包含在天然淀粉中。例如，可以使用由100％支链淀粉组成的蜡质种玉米淀粉作为支链淀粉。

　　淀粉是直链淀粉和支链淀粉的混合物。可以使用通常市售的任何淀粉作为淀粉。包含在淀粉中的直链淀粉与支链淀粉的比例变化取决于制备该淀粉的植物的类型。包含在糯米、蜡质种玉米等中的大多数淀粉是支链淀粉。淀粉可以分成天然淀粉、淀粉降解产物和加工的淀粉。

　　天然淀粉根据其原料来源又分成块茎淀粉和谷物淀粉。块茎淀粉的例子包括马铃薯淀粉、木薯淀粉、甘薯淀粉、葛藤淀粉、蕨菜淀粉等。谷物淀粉的例子包括玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉等。

　　加工的淀粉是天然淀粉经过处理如水解、酯化作用、凝胶化作用等从而带来一些使其更便于利用的性能而获得的淀粉。可获得具有各种综合性能(例如凝胶化起始温度、淀粉糊粘度、淀粉糊透明度、老化稳定性等)的多种加工的淀粉。各种类型的加工的淀粉都存在。这种淀粉的一个例子是如下获得的淀粉，即将淀粉颗粒在不超过该淀粉凝胶化温度的温度下浸在酸中，从而劈开淀粉分子而不切断淀粉颗粒。

　　淀粉降解产物是使淀粉经过处理如酶处理、水解等获得的寡糖或者多糖，其具有比处理之前更低的分子量。淀粉降解产物的例子包括通过脱支酶降解的淀粉、磷酸化酶降解的淀粉和通过部分水解降解的淀粉。

　　脱支酶降解淀粉是通过使脱支酶作用于淀粉来获得的。通过不同程度地改变脱支酶的作用时间，可以获得支链部分(即α-1，6-葡糖苷键)被分裂成任何程度的脱支酶降解淀粉。脱支酶降解淀粉的例子包括具有4-10,000个带有1-20个α-1，6-葡糖苷键的糖单元的降解产物、具有3-500个不带有任何α-1，6-葡糖苷键的糖单元的降解产物、麦芽寡糖和直链淀粉。在通过脱支酶降解淀粉的情况下，所得降解产物的分子量分布随被降解的淀粉类型而变化。脱支酶降解的淀粉可以是具有各种长度的糖链的混合物。

　　通过水解部分降解的糊精和淀粉是指通过酸、碱、酶等的作用部分降解淀粉所获得的降解产物。在本发明中，经水解部分降解的糊精和淀粉所包含的糖单元数优选是约10-100,000，更优选约50-50,000，甚至更优选约100-10,000。就水解部分降解的糊精和淀粉而言，所得降解产物的分子量分布随被降解的淀粉类型而变化。水解部分降解的糊精和淀粉可以是具有各种长度的糖链的混合物。

　　纤维素是由通过β-1，4-葡糖苷键连接在一起的葡萄糖单元组成的直链分子。

　　糖可以原本就含在含有含疏水基的水溶性有机化合物的水溶液中，或者可以被加到含有含疏水基的水溶性有机化合物的水溶液中。糖优选原本就含在含有含疏水基的水溶性有机化合物的水溶液中。这种水溶液的例子包括上述的糖基化反应溶液和果汁。

　　糖优选是小分子的。当溶液包含相对高分子量的多糖(糖基化反应溶液就是如此)时，可以将裂解糖链的酶(如葡糖淀粉酶)加到待反应的溶液中，由此将多糖降解为单糖或寡糖。优选在将水溶液与有机溶剂接触前将其中的多糖降解为单糖或寡糖。优选所有糖均溶于水溶液中。然而，糖可以部分悬浮在水溶液中，只要糖不妨碍水溶液与有机溶剂的分离。

　　水溶液中的糖浓度可以是任何浓度。优选水溶液中的糖浓度至少为12％，更优选至少20％，更加优选至少30％，更加优选至少40％，最优选至少50％。只要糖和含疏水基的水溶性有机化合物不沉淀，糖浓度的上限可以是任何浓度。例如，上限为不超过90％，不超过80％，不超过70％，不超过60％，或不超过55％。

　　水溶液的糖浓度可以通过本领域已知的方法测定。例如，一种简单方法是使用白利糖度(Brix scale)的测量方法。使用白利糖度的测量方法简单，但不能分别测定每一种糖。例如，为了分别测定每一种糖，可以使用柱LiChrosorb NH2(Merck制造；4.0×250毫米)并且使用25∶75(v/v)的水和乙腈的混合物作为流动相，对含糖的水溶液进行高效液相色谱分析，并且可以使用RI检测器测定洗脱物。

　　本文所用的“极性有机溶剂”是指对氧化铝的溶剂强度(ε°)至少为0.4并可与蒸馏水混溶的有机溶剂。极性有机溶剂的溶剂强度优选为0.42-0.98，更优选0.44-0.95，最优选0.44-0.90。极性有机溶剂可以是在20℃下的介电常数至少为7.0的有机溶剂。优选极性有机溶剂在20℃下的介电常数为7.3-40.0，更优选7.4-39.0，最优选7.5-38.0。

　　对氧化铝的溶剂强度的例子列在表1中。介电常数的例子列在表2中。用于本发明的极性有机溶剂的例子包括列在下表1和2中的极性有机溶剂，其溶剂强度或介电常数在上述范围内。

　　极性有机溶剂优选为四氢呋喃、异丙醇、乙腈、丙酮、乙醇、甲醇、丙醇、吡啶或二甲氧基亚砜，更优选是四氢呋喃、异丙醇、乙腈或丙酮，最优选是四氢呋喃或乙腈。当水溶液还包含相分离助剂时，极性有机溶剂优选是四氢呋喃、乙腈、丙酮或异丙醇，更优选为丙酮或异丙醇。

　　极性有机溶剂优选是单一化合物。然而，也可以使用至少两种极性有机溶剂的混合物，只要有机相不分成两相。本领域技术人员可以根据需要来选择适用于从水溶液中萃取含疏水基的水溶性有机化合物的极性有机溶剂。

　　与水溶液接触的极性有机溶剂的量典型地为水溶液体积的0.1-10倍，更优选0.2-2倍。

　　水溶液可以包含相分离助剂。本文所用的“相分离助剂”是指有助于水溶液和极性有机溶剂的混合物分离成水相和有机相的物质。注意，糖和含疏水基的水溶性有机化合物不是相分离助剂，即使它们具有促进相分离的作用。相分离助剂可以是具有盐析效应的盐和能增强离子强度的水溶性物质。相分离助剂可以是盐或有机酸。相分离助剂的例子包括但是不局限于，硫酸盐(如硫酸铵和硫酸镁)、钠盐(例如氯化钠和和亚硫酸钠)、磷酸盐(例如磷酸钾、磷酸钠、磷酸镁和磷酸铵)、乙酸盐(例如乙酸钠和乙酸钾)、乳酸盐(例如乳酸钠和乳酸镁)、有机酸(例如柠檬酸、柠檬酸钠、抗坏血酸、抗坏血酸钠和苹果酸)和氯化铵。相分离助剂优选是盐，更优选选自氯化钠、柠檬酸钠、硫酸镁和硫酸铵。

　　相分离助剂可以包含在水溶液中，其数量足以促进相分离。这种数量为本领域技术人员所公知。水溶液中包含的相分离助剂的浓度优选为至少5％，更优选10％，更加优选至少15％，最优选至少20％。尽管优选不超过50％并且更优选不超过40％，但是相分离助剂的量没有特定的上限。

　　优选相分离助剂预先包含在水溶液中。然而，可以在水溶液和极性有机溶剂相互接触的同时加入相分离助剂。

　　可以通过本领域技术人员公知的方法来制备包含含疏水基的水溶性有机化合物和糖的水溶液。这种水溶液可以是在进行了酶反应后不经任何处理的酶反应溶液，或是在进行了酶反应后经过浓缩、稀释、过滤或pH调节的酶反应溶液。具体地说，当酶反应溶液的粘度太高而不能搅拌时，优选稀释该酶反应溶液。或者，可以通过将相分离助剂加入包含含疏水基的水溶性有机化合物和糖的酶反应溶液或其浓缩液中来制备水溶液。

　　水溶液也可以是选自动物或植物的有机体的萃取物，其包含含疏水基的水溶性有机化合物。可以通过本领域已知的方法萃取含有含疏水基的水溶性有机化合物的动物材料或植物材料来制备这种萃取物。示范性的萃取法包括：将包含含疏水基的水溶性有机化合物的动物材料或植物材料加入萃取溶剂，如水(例如温度超过0℃并低于40℃的水)、温水(例如温度不低于40℃并低于60℃的水)、热水(例如温度不低于60℃并低于100℃的水)、醇、吡啶、乙酸乙酯或其混合物；使含疏水基的水溶性有机化合物从动物材料或植物材料中转移到萃取溶剂中；从萃取溶剂中除去动物材料和植物材料，获得萃取溶液；并且根据需要浓缩或干燥萃取溶液。优选萃取物不包含有机溶剂。当萃取溶剂是有机溶剂时，优选通过浓缩萃取溶液来除去有机溶剂。萃取物可以是液体或固体。通过压榨动物材料或植物材料所获得的汁液在这里也包括在萃取物的定义范围内。优选水溶液是果汁。动物材料可以是整个动物或动物的任何器官或组织。植物材料可以是整个植物或植物的任何器官(例如花、果实、种子、根、茎和叶)或组织。待萃取的动物材料和植物材料可以是未处理的或干燥过的。如果萃取物是水溶液，则可以将该萃取物直接用于本发明。可以通过浓缩、稀释等从萃取物制备水溶液。具体地说，当萃取物的粘度太高而不能搅拌时，优选稀释该萃取物。注意，只要所研究的含疏水基的水溶性有机化合物溶于用于本发明方法的水溶液中，就可以将任何其它的成分悬浮在其中。或者，可以通过将相分离助剂加入包含含疏水基的水溶性有机化合物和糖的动物萃取物、包含含疏水基的水溶性有机化合物和糖的植物萃取物或这些萃取物的浓缩液或稀释液中来制备水溶液。例如，可以通过将相分离助剂加入果汁或其浓缩液中来制备水溶液。

　　优选将选自水杨苷、松柏苷、熊果苷、番泻叶苷、甜菊苷、rubsoside、芸香苷、橙皮苷、柚皮苷、黄豆苷、染料木苷、barbaroin、香草醛、皂草苷、黄连素、堪非醇、黄芩苷、茵陈素、儿茶素、延胡索碱、七叶苷原、表儿茶精、姜辣素和甘草甜素的有效成分溶于萃取物溶液。

　　在本发明方法中，包含含疏水基的水溶性有机化合物和糖的水溶液与极性有机溶剂接触，获得水相和有机相，由此将含疏水基的水溶性有机化合物转入有机相中。

　　可通过，例如混合水溶液和极性有机溶剂来使该水溶液和极性有机溶剂相互接触。使水溶液和极性有机溶剂相互接触也称为萃取。水溶液和极性有机溶剂相互接触时的温度优选为10-50℃，更优选25-45℃，更加优选20-40℃，最优选25-35℃。

　　混合并搅拌水溶液和极性有机溶剂，随后使其静置，从而分离为水相和有机相。通常，水相和有机相形成各自的层，即水层和有机层。通常溶剂层具有更大的比重，所以是下层。在使用比重比水小的有机溶剂时，则一般水层是下层，而上层是有机层。

　　一般，水相包含少量极性有机溶剂，而有机相包含少量水。例如，将丙酮加入包含含疏水基的水溶性有机化合物(例如橙皮苷和芸香苷)的水溶液或悬浮液，再搅拌，然后静置。当它们分成水相和有机相(丙酮相)时，就有少量水溶于丙酮相中。因此，与有机相中不含水的情况相比，含疏水基的水溶性有机化合物的溶解度增加，使得该含疏水基的水溶性有机化合物有效地溶于丙酮中。

　　当混合水溶液和极性有机溶剂使其相互接触时，优选搅拌混合物。搅拌方法的例子包括但是不局限于：旋转、摇动以及同时旋转并摇动。为了有效地萃取和提纯含疏水基的水溶性有机化合物，可以使用多级逆流分配设备(也称为连续液-液萃取设备)。

　　本发明方法特别适用于提纯苯酚衍生物苷。苯酚衍生物苷的提纯将作为实施例更详细地进行描述。

　　例如，可以通过在酶存在下使糖(例如麦芽寡糖或淀粉)与苯酚衍生物起反应而形成苯酚衍生物苷。一般，该反应在某一程度下到达平衡，不会进一步进行。因此，在这一酶反应溶液中存在苯酚衍生物、苯酚衍生物苷和糖。当酶反应溶液包含多糖或寡糖时，可以将糖解酶(如葡糖淀粉酶)加到该酶反应溶液中，随后进行培养，以便将酶反应溶液中的多糖或寡糖降解为单糖。多糖或寡糖降解为单糖增加了糖的摩尔值(即摩尔浓度)而没有改变其总重，从而促进了水相和有机相的分离。在将酶反应溶液和极性有机溶剂相互接触来获得第一水相和包含少量水的有机相时，苯酚衍生物和苯酚衍生物苷转入有机相中。如上所述，为了促进相分离，可以将相分离助剂加到水相中以获得包含相分离助剂的水溶液，然后再将水溶液与极性有机溶剂接触。

　　此后回收包含少量水的有机相。苯酚衍生物和苯酚衍生物苷包含疏水性部分，使其对于有机相具有比糖更高的亲合力。因此，苯酚衍生物和苯酚衍生物苷有效地转入有机相中，而糖较少地转入有机相中。因此，苯酚衍生物和苯酚衍生物苷被萃取到回收的有机相中。通常，假定将相同总量的极性有机溶剂用于分配萃取，如果将极性有机溶剂分成若干等份并将这些等份用来从水溶液中多次进行萃取，则萃取效率大于将总量的极性有机溶剂一次性与水溶液相接触来进行萃取时的萃取效率。因此，将如下步骤进行两次或多次：使回收有机相后残余的水相与极性有机溶剂相接触，以便再次获得水相和包含少量水的有机相，并且回收有机相。有机相的回收操作进行至少两次，获得的有机相可以合并在一起并用于随后的步骤。

　　此后从包含少量水的有机相中除去极性有机溶剂。从有机相中除去极性有机溶剂的方法可以是本领域技术人员公知的任何方法。这种方法的例子包括使用蒸发器来进行浓缩。可以完全除去极性有机溶剂，或保留少量极性有机溶剂，只要它不妨碍随后的步骤就可以。除去极性有机溶剂后，苯酚衍生物和苯酚衍生物苷留在含于极性有机溶剂中的少量水中。在这个去除步骤中，优选避免许多水被除去。在这个去除步骤中，优选苯酚衍生物和苯酚衍生物苷不发生沉淀。如果苯酚衍生物和苯酚衍生物苷沉淀，则优选通过添加水来溶解苯酚衍生物和苯酚衍生物苷。因而获得包含苯酚衍生物和苯酚衍生物苷的第二水溶液。

　　此后使第二水溶液与乙酸乙酯接触来获得第二水相和乙酸乙酯相，以便使苯酚衍生物转入乙酸乙酯相中。

　　然后回收第二水相。因为苯酚衍生物不包含苷部分，所以苯酚衍生物对于乙酸乙酯相具有比苯酚衍生物苷更高的亲合力。因此，苯酚衍生物有效地转入乙酸乙酯相中，而苯酚衍生物苷较少地转入乙酸乙酯相中。因此，苯酚衍生物苷留在回收的水相中。当少量糖留在第二溶液中时，糖将留在水相中。和使水溶液与极性有机溶剂接触的步骤以及回收有机相的步骤一样，可以将以下步骤进行至少两次：使除去乙酸乙酯相后残余的水相与乙酸乙酯接触，以便再次获得水相和乙酸乙酯相，并回收第二水相。

　　注意，尽管在本文所描述的方法中，使有机相与乙酸乙酯接触的步骤在使水溶液与极性有机溶剂接触的步骤以及回收有机相的步骤之后进行，但是也可以在使水相与极性有机溶剂接触前使水溶液与乙酸乙酯接触并回收水相。

　　然后将第二水相浓缩并冷却，以便沉淀苯酚衍生物苷。优选将第二水相浓缩以使得苯酚衍生物苷在第二水相中的浓度达到至少10％，优选至少15％，更优选至少20％，最优选至少25％。这利用苯酚衍生物苷在水中的饱和浓度比糖在水中的饱和浓度更低来进行。例如，假定糖是葡萄糖而苯酚衍生物苷是氢醌苷，就利用了葡萄糖在水中的饱和浓度为约18％而氢醌苷在水中的饱和浓度为约10％。

　　将葡萄糖、蔗糖和果糖用作各种糖的代表来研究其对水溶液和极性有机溶剂的相分离的影响。

　　具体地说，将葡萄糖、蔗糖或果糖溶于水中，制备10％、15％、20％、25％、30％和50％的水溶液。将10ml乙腈或四氢呋喃加入10ml的各种糖的水溶液中，随后用分液漏斗强烈振摇5分钟。乙腈和四氢呋喃都是可与水混溶的极性有机溶剂，当它们与水混合时，混合物不分离为水相和有机相。振摇后，将混合物静置30分钟，观察混合物是否分成两相，即水相和有机相。向各水溶液中加入四氢呋喃或乙腈的结果列在表3-5中。在表中，THF代表四氢呋喃，AcCN代表乙腈。

　　葡萄糖50％30％25％20％15％10％AcCN是是是是是否THF是是是否否否

　　蔗糖50％30％25％20％15％10％AcCN是是是是否否THF是否否否否否

　　果糖50％30％25％20％15％10％AcCN是是是是否否THF是是否否否否

　　如表3-5所示，人们发现当乙腈或四氢呋喃与糖的水溶液混合时，存在一定量的糖时就会发生相分离。

　　根据结果人们发现，调节含于水溶液中的糖的类型和浓度可能促进相分离，例如优选调节糖浓度为至少约12％。

　　具体地说，将氯化钠分别加入葡萄糖浓度为25％或50％以及20％或10％的葡萄糖水溶液中，制备含氯化钠的葡萄糖水溶液。将10ml丙酮或异丙醇(其是极性有机溶剂)加入10ml的各种水溶液中，随后用分液漏斗强烈振摇5分钟。振摇后，将混合物静置30分钟，观察混合物是否分成两相。结果列在表6中。

　　将柠檬酸钠加入糊精浓度为25％的水溶液中，加入糊精浓度为20％的水溶液中，制备含柠檬酸钠的糊精水溶液。注意，糊精是MatsutaniChemical Industry Co.，Ltd.制造的PINE-DEX #1，其DE为7-9。本文所用的“DE”是显示淀粉降解度的指数，其是糖变为葡萄糖后含固量减少的百分数。将硫酸镁加入葡萄糖浓度为25％的水溶液中，加入葡萄糖浓度为10％的水溶液中，制备含硫酸镁的葡萄糖水溶液。将10ml丙酮(其是极性有机溶剂)加入10ml的各种水溶液中，随后用分离剂强烈搅拌5分钟。

　　如表6和7所示，将含氯化钠的葡萄糖水溶液、含柠檬酸钠的糊精水溶液和含硫酸镁的葡萄糖水溶液分别与丙酮或异丙醇混合时发生相分离。加入盐如氯化钠、柠檬酸钠或硫酸镁可以导致极性有机溶剂发生相分离，而在50％的糖的水溶液的情况下其却不发生相分离。结果发现盐如氯化钠可用作相分离助剂。人们相信，盐通过提高溶解有该盐的水溶液的离子强度而起到相分离助剂的作用。因此，任何能够提高离子强度的物质都被认为能够用作相分离助剂。

　　将1g儿茶素混合物(SUNPHENON；Taiyo Kagaku Co.，Ltd.制造)溶于100ml包含30％葡萄糖的水溶液中，得到水溶液样品。测定水溶液样品在280nm处的吸光度。将10ml四氢呋喃加入10ml的水溶液样品中，随后用分液漏斗强烈振摇5分钟。此后将混合物静置30分钟。结果混合物分成两相。回收下面的相(水相)，测定其体积和在280nm处的吸光度。由下层相在280nm处的吸光度减少和下层相的溶液体积计算出萃取进入上层相(极性有机溶剂相)的儿茶素的量。结果发现，通过单次萃取操作，儿茶素起始量的94.1％被萃取进入四氢呋喃相中。

　　除使用10ml乙腈来代替10ml四氢呋喃外，进行同实施例1a的另外的萃取操作。结果发现，通过单次萃取操作，儿茶素起始量的84.4％被萃取进入乙腈相中。

　　将1g儿茶素混合物(SUNPHENON：Taiyo Kagaku制造)溶于100ml包含30％葡萄糖和10％氯化钠的水溶液中，得到水溶液样品。测定水溶液样品在280nm处的吸光度。将10ml丙酮加入10ml的水溶液样品中，随后用分液漏斗强烈振摇5分钟。此后将混合物静置30分钟。结果混合物分成两相。回收下层相(水相)，测定其体积和在280nm处的吸光度。由下层相在280nm处的吸光度减少和下层相的溶液体积计算出萃取进入上层相(极性有机溶剂相)的儿茶素的量。结果发现，通过单次萃取操作，儿茶素起始量的91.8％被萃取进入丙酮相中。

　　除使用10ml异丙醇来代替10ml丙酮外，进行同实施例2a的另外的萃取操作。结果发现，通过单次萃取操作，儿茶素起始量的93.2％被萃取进入异丙醇相中。

　　将1g橙皮苷基糖苷(Toyo Sugar Refining Co.，Ltd.制造)溶于100ml包含30％葡萄糖的水溶液中，得到水溶液样品。测定水溶液样品在280nm处的吸光度。将10ml四氢呋喃加入10ml的水溶液样品中，随后用分液漏斗强烈振摇5分钟。此后将混合物静置30分钟。结果混合物分成两相。回收下层相(水相)，测定其体积和在280nm处的吸光度。由下层相在280nm处的吸光度减少和下层相的溶液体积计算出萃取进入上层相(极性有机溶剂相)的橙皮苷基糖苷的量。结果发现，通过单次萃取操作，橙皮苷基糖苷起始量的50.0％被萃取进入四氢呋喃相中。另外，通过在四氢呋喃萃取后向回收的水相中加入5ml四氢呋喃再进行两次类似的操作和测定。结果发现，萃取了总共80.0％的橙皮苷基糖苷。

　　除使用10ml乙腈来代替10ml四氢呋喃外，进行同实施例3a的另外的萃取操作。结果发现，通过单次萃取操作，橙皮苷基糖苷起始量的27.6％被萃取进入乙腈相中。

　　将1g橙皮苷基糖苷(Toyo Sugar Refining Co.，Ltd.)溶于100ml包含30％葡萄糖和10％氯化钠的水溶液中，得到水溶液样品。测定水溶液样品在280nm处的吸光度。将10ml丙酮加入10ml的水溶液样品中，随后用分液漏斗强烈振摇5分钟。此后将混合物静置30分钟。结果混合物分成两相。回收下层相(水相)，测定其体积和在280nm处的吸光度。由下层相在280nm处的吸光度减少和下层相的溶液体积计算出萃取进入上层相(极性有机溶剂相)的橙皮苷基糖苷的量。结果发现，通过单次萃取操作，橙皮苷基糖苷起始量的43.5％被萃取进入丙酮相中。另外，通过在丙酮提取后向回收的水相中加入5ml丙酮再进行两次类似的操作和测定。结果发现，萃取了总共90.0％的橙皮苷基糖苷。

　　除使用10ml异丙醇来代替10ml丙酮外，进行同实施例4a的另外的萃取操作。结果发现，通过单次萃取操作，橙皮苷基糖苷起始量的32.0％被萃取进入异丙醇相中。

　　将1g水杨苷溶于100ml包含30％葡萄糖的水溶液中，得到水溶液样品。测定水溶液样品在280nm处的吸光度。将10ml四氢呋喃加入10ml的水溶液样品中，随后用分液漏斗强烈振摇5分钟。此后将混合物静置30分钟。结果混合物分成两相。回收下层相(水相)，测定其体积和在280nm处的吸光度。由下层相在280nm处的吸光度减少和下层相的溶液体积计算出萃取进入上层相(极性有机溶剂相)的水杨苷的量。结果发现，通过单次萃取操作，水杨苷起始量的96.5％被萃取进入四氢呋喃相中。

　　除使用10ml乙腈来代替10ml四氢呋喃外，进行同实施例5a的另外的萃取操作。结果发现，通过单次萃取操作，水杨苷起始量的98.1％被萃取进入乙腈相中。

　　将1g水杨苷溶于100ml包含30％葡萄糖和10％氯化钠的水溶液中，得到水溶液样品。测定水溶液样品在280nm处的吸光度。将10ml丙酮加入10ml的水溶液样品中，随后用分液漏斗强烈振摇5分钟。此后将混合物静置30分钟。结果混合物分成两相。回收下层相(水相)，测定其体积和在280nm处的吸光度。由下层相在280nm处的吸光度减少和下层相的溶液体积计算出萃取进入上层相(极性有机溶剂相)的水杨苷的量。结果发现，通过单次萃取操作，水杨苷起始量的58.0％被萃取进入丙酮相中。

　　除使用10ml异丙醇来代替10ml丙酮外，进行同实施例6a的另外的萃取操作。结果发现，通过单次萃取操作，水杨苷起始量的97.0％被萃取进入异丙醇相中。

　　将1g咖啡酸溶于100ml包含30％葡萄糖的水溶液中，得到水溶液样品。测定水溶液样品在280nm处的吸光度。将10ml四氢呋喃加入10ml的水溶液样品中，随后用分液漏斗强烈振摇5分钟。此后将混合物静置30分钟。结果混合物分成两相。回收下层相(水相)，测定其体积和在280nm处的吸光度。由下层相在280nm处的吸光度减少和下层相的溶液体积计算出萃取进入上层相(极性有机溶剂相)的咖啡酸的量。结果发现，通过单次萃取操作，咖啡酸起始量的88.6％被萃取进入四氢呋喃相中。

　　除使用10ml乙腈来代替10ml四氢呋喃外，进行同实施例7a的另外的萃取操作。结果发现，通过单次萃取操作，咖啡酸起始量的76.2％被萃取进入乙腈相中。

　　将1g咖啡酸溶于100ml包含30％葡萄糖和10％氯化钠的水溶液中，得到水溶液样品。测定水溶液样品在280nm处的吸光度。将10ml丙酮加入10ml的水溶液样品中，随后用分液漏斗强烈振播5分钟。此后将混合物静置30分钟。结果混合物分成两相。回收下层相(水相)，测定其体积和在280nm处的吸光度。由下层相在280nm处的吸光度减少和下层相的溶液体积计算出萃取进入上层相(极性有机溶剂相)的咖啡酸的量。结果发现，通过单次萃取操作，咖啡酸起始量的78.2％被萃取进入丙酮相中。

　　除使用10ml异丙醇来代替10ml丙酮外，进行同实施例8a的另外的萃取操作。结果发现，通过单次萃取操作，咖啡酸起始量的87.2％被萃取进入异丙醇相中。

　　将1g水杨醇溶于100ml包含30％葡萄糖的水溶液中，得到水溶液样品。测定水溶液样品在280nm处的吸光度。将10ml四氢呋喃加入10ml的水溶液样品中，随后用分液漏斗强烈振摇5分钟。此后将混合物静置30分钟。结果混合物分成两相。回收下层相(水相)，测定其体积和在280nm处的吸光度。由下层相在280nm处的吸光度减少和下层相的溶液体积计算出萃取进入上层相(极性有机溶剂相)的水杨醇的量。结果发现，通过单次萃取操作，水杨醇原料的98.7％被萃取进入四氢呋喃相中。

　　除使用10ml乙腈来代替10ml四氢呋喃外，进行同实施例9a的另外的萃取操作。结果发现，通过单次萃取操作，水杨醇起始量的98.2％被萃取进入乙腈相中。

　　将1g水杨醇溶于100ml包含30％葡萄糖和10％氯化钠的水溶液中，得到水溶液样品。测定水溶液样品在280nm处的吸光度。将10ml丙酮加入10ml的水溶液样品中，随后用分液漏斗强烈振摇5分钟。此后将混合物静置30分钟。结果混合物分成两相。回收下层相(水相)，测定其体积和在280nm处的吸光度。由下层相在280nm处的吸光度减少和下层相的溶液体积计算出萃取进入上层相(极性有机溶剂相)的水杨醇的量。结果发现，通过单次萃取操作，水杨醇起始量的87.7％被萃取进入丙酮相中。

　　除使用10ml异丙醇来代替10ml丙酮外，进行同实施例10a的另外的萃取操作。结果发现，通过单次萃取操作，水杨醇起始量的98.7％被萃取进入异丙醇相中。

　　用水将甜茶萃取物水溶液(SUNTENCHA；Suntory Ltd.制造)稀释两倍，获得两倍稀释液。加入葡萄糖和氯化钠，并溶于该两倍稀释液中，其浓度分别为10％和10％，得到水溶液。测定水溶液在280nm处的吸光度。将20ml丙酮加入20ml的水溶液中，随后用分液漏斗强烈振摇5分钟。此后将混合物静置30分钟。结果混合物分成两相。回收下层相(水相)，测定其体积和在280nm处的吸光度。由下层相在280nm处的吸光度减少和下层相的溶液体积计算出萃取进入上层相(极性有机溶剂相)的有效成分(即鞣花单宁及其聚合物)的量。结果发现，通过单次萃取操作，43.1％的有效成分被萃取进入丙酮相中。另外，丙酮相中的着色程度是水相的约1/3。因而发现，通过萃取操作，萃取了有效成分，并获得了脱色作用效果。

　　将10ml的15％氯化钠溶液加入10ml脐橙汁浓缩物(五倍浓缩物)中，搅拌均匀，由此得到水溶液。通过使用柱ODS进行HPLC测定所用脐橙汁浓缩物中的橙皮苷量，其中流动相为20∶80的乙腈和水的混合物，流速为0.5ml/min，柱温为40℃。在280nm处检测洗脱物的吸光度。检测橙皮苷量的具体方法描述在日本公开专利8-80177中。将20ml丙酮加入20ml的所得水溶液中，随后用分液漏斗强烈振摇5分钟。此后将混合物静置30分钟。结果混合物分成两相。回收上层相(极性有机溶剂相)，并测定其体积。如上所述使用HPLC测定橙皮苷的量。结果，通过单次萃取操作，75％的橙皮苷被萃取进入丙酮相中。

　　用盐酸将溶解有5％可溶性淀粉(Merck制造)和0.5％橙皮苷的水溶液调节至pH9.0。将耐碱性的CGTase(描述在日本公开专利7-107972中)加入水溶液，至浓度为5单元/ml。其后在37℃下进行16小时的酶反应。酶反应结束后，收集一部分酶反应溶液，通过HPLC分析法测定橙皮苷和橙皮苷基糖苷的量。在HPLC分析法中，使用LiChrospher 100RP18(Merck；4.0×250mm)柱，其中流动相为20∶80的乙腈和水的混合物，流速为0.5ml/min，柱温为40℃。在280nm处检测洗脱物的吸光度。分析橙皮苷和橙皮苷基糖苷量的方法描述在日本公开专利8-80177中。结果发现，由于酶反应，使得反应开始时加入的橙皮苷的约80％转变为橙皮苷基糖苷。

　　其后，酶反应后将葡萄糖和氯化钠加入并溶于酶反应溶液中，其浓度分别为20％和10％，得到包含葡萄糖和氯化钠的酶反应溶液。将等体积的丙酮加入该包含葡萄糖和氯化钠的酶反应溶液中，随后使用分液漏斗强烈振摇5分钟。将混合物静置30分钟。结果混合物分成两相。收集上层丙酮相并测定其体积，如上所述通过HPLC测定溶于丙酮相中的橙皮苷基糖苷的量。结果，酶反应结束后存在于酶反应溶液中的橙皮苷基糖苷的约45％被萃取进入丙酮相。另外，将等于酶反应溶液一半体积的丙酮加入下层水相，搅拌，静置，然后回收上层相。再进行三次同样的萃取操作。结果能够回收所有的橙皮苷基糖苷。

　　用5N的氢氧化钠水溶液将溶解有35％糊精(PINE-DEX #1，其中DE为7-9；Matsutani Chemical Industry Co.，Ltd.制造)和15％氢醌的水溶液调节为pH6.5。将糖基化酶(淀粉酶X-23，描述在日本公开专利6-277053中)加入该水溶液中，浓度为20单元/ml。其后，在45℃下培养40小时，发生氢醌糖基化反应。酶反应结束后，收集一部分酶反应溶液，通过HPLC分析法测定氢醌和氢醌苷的量。在HPLC分析法中，使用LiChrospher 100RP18(Merck；4.0×250mm)柱，其中流动相为80∶19.7∶0.3(v/v)的水、甲醇和磷酸的混合物，流速为0.5ml/min，柱温为40℃。通过紫外分光光度法检测洗脱物中氢醌和氢醌苷的量。使用酶反应溶液，通过HPLC分析法测定产物麦芽寡糖的量。在HPLC分析法中，使用LiChrosorb NH2(Merck；4.0×250mm)柱，其中流动相为25∶75的水和乙腈的混合物，流速为1.0ml/min，柱温为40℃。通过RI检测器检测洗脱物中的麦芽寡糖。结果发现，由于酶反应，使得约35％的氢醌转变为氢醌苷，并且使糊精降解为葡萄糖和麦芽寡糖。另外，在酶反应结束后将葡糖淀粉酶(NagaseChemtex制造；商品名为XL-4)加入酶反应溶液中，浓度为8.8单元/ml，随后在45℃下培养3小时，由此将酶反应溶液中的寡糖降解为葡萄糖。

　　其后，在寡糖降解结束后将等体积的四氢呋喃加入酶反应溶液中，随后使用分液漏斗强烈振摇5分钟。将混合物静置30分钟。结果混合物分成两相。回收上层四氢呋喃相，并测定其体积。如上所述通过HPLC分析溶于四氢呋喃相中的氢醌苷的量。结果，酶反应结束后存在于酶反应溶液中的氢醌苷的约65％被萃取进入四氢呋喃相。另外，将等于酶反应溶液一半体积的四氢呋喃加入下层水相中，搅拌，静置，然后回收上层相。再进行三次萃取操作。结果能够回收所有的氢醌苷。

　　用5N的氢氧化钠水溶液将溶解有35％糊精(PINE-DEX #1，其中DE为7-9；Matsutani Chemical Industry Co.，Ltd.制造)和15％氢醌的水溶液调节为pH6.5。将糖基化酶(淀粉酶X-23，描述在日本公开专利6-277053中)加入该水溶液中，浓度为20单元/ml。其后，在45℃下培养40小时，产生氢醌糖基化反应。酶反应结束后，收集一部分酶反应溶液，通过HPLC分析法测定氢醌和氢醌苷的量。在HPLC分析法中，使用LiChrospher 100RP18(Merck；4.0×250mm)柱，其中流动相为80∶19.7∶0.3(v/v)的水、甲醇和磷酸的混合物，流速为0.5ml/min，柱温为40℃。通过紫外分光光度法检测洗脱物中氢醌和氢醌苷的量。使用酶反应溶液，通过HPLC分析法测定产物麦芽寡糖的量。在HPLC分析法中，使用LiChrosorb NH2(Merck；4.0×250mm)柱，其中流动相为25∶75的水和乙腈的混合物，流速为1.0ml/min，柱温为40℃。通过RI检测器检测洗脱物中的麦芽寡糖。结果发现，由于酶反应，使得约35％的氢醌转变为氢醌苷，并且使糊精降解为葡萄糖和麦芽寡糖。另外，在酶反应结束后将葡糖淀粉酶(NagaseChemtex制造；商品名为XL-4)加入酶反应溶液中，浓度为8.8单位/ml，随后在45℃下培养3小时，由此将酶反应溶液中的寡糖降解为葡萄糖。

　　其后，在寡糖降解后使用蒸发器将酶反应溶液线。将硫酸铵加入该浓缩物中，浓度为20％，得到包含硫酸铵的浓缩物。将等体积的丙酮加入该包含硫酸铵的浓缩物中，随后使用分液漏斗强烈振摇5分钟。将混合物静置30分钟。结果混合物分成两相。回收上层丙酮相，并测定其体积。如上所述通过HPLC分析溶于丙酮相中的氢醌苷的量。结果，酶反应结束后存在于酶反应溶液中的氢醌苷的约60％被萃取进入丙酮相。另外，将等于浓缩物0.8倍体积的丙酮加入下层水相中，搅拌，静置，然后回收上层相。再进行三次同样的萃取操作。结果能够回收所有的氢醌苷。

　　用5N的氢氧化钠水溶液将溶解有35％糊精(PINE-DEX #1，其中DE为7-9；Matsutani Chemical Industry Co.，Ltd.制造)和15％氢醌的水溶液调节为pH6.5。将糖基化酶(淀粉酶X-23，描述在日本公开专利6-277053中)加入该水溶液中，浓度为20单元/ml。其后，在45℃下培养40小时，发生氢醌糖基化反应。酶反应结束后，收集一部分酶反应溶液，通过HPLC分析法测定氢醌和氢醌苷的量。在HPLC分析法中，使用LiChrospher 100RP18(Merck；4.0×250mm)柱，其中流动相为80∶19.7∶0.3(v/v)的水、甲醇和磷酸的混合物，流速为0.5ml/min，柱温为40℃。通过紫外分光光度法检测洗脱物中氢醌和氢醌苷的量。使用酶反应溶液，通过HPLC分析法测定产物麦芽寡糖的量。在HPLC分析法中，使用LiChrosorb NH2(Merck；4.0×250mm)柱，其中流动相为25∶75的水和乙腈的混合物，流速为1.0ml/min，柱温为40℃。通过RI检测器检测洗脱物中的麦芽寡糖。结果发现，由于醇反应，使得约35％的氢醌转变为氢醌苷，并且使糊精降解为葡萄糖和麦芽寡糖。另外，在酶反应结束后将葡糖淀粉酶(NagaseChemtex制造；商品名为XL-4)加入酶反应溶液中，浓度为8.8单元/ml，随后在45℃下培养3小时，由此将酶反应溶液中的寡糖降解为葡萄糖。

　　其后，在寡糖降解结束后将等体积的乙腈加入酶反应溶液中，随后使用分液漏斗强烈振摇5分钟。将混合物静置1小时。结果混合物分成两相。回收上层乙腈相，并测定其量。如上所述通过HPLC分析溶于乙腈相中的氢醌苷的量。结果，酶反应结束后存在于酶反应溶液中的氢醌苷的约30％被萃取进入乙腈相。另外，将与酶反应溶液等体积的乙腈加入下层水相中，搅拌，静置，然后回收上层相。再进行五次同样的萃取操作。结果，能够回收酶反应结束后存在于酶反应溶液中约90％的氢醌苷。

　　使用糊精或淀粉作为原料进行糖基化酶反应时，反应结束后的酶反应溶液中存在大量比原料分子量更低的葡萄糖和糊精。甚至总糖浓度相同时，摩尔值越高，则越少的糖转入有机相。因此，为了将糖基化酶反应结束后残余的糊精有效地降解为葡萄糖，而研究了糊精降解反应的条件。

　　用5N的氢氧化钠水溶液将溶解有35％糊精(PINE-DEX #1，其中DE为7-9：Matsutani Chemical Industry Co.，Ltd.制造)和15％氢醌的水溶液调节为pH6.5。将糖基化酶(淀粉酶X-23，描述在日本公开专利6-277053中)加入该水溶液中，浓度为20单元/ml。其后，在45℃下培养40小时，产生氢醌糖基化反应。

　　反应结束后将1.4μl(1倍量)、2.1μl(1.5倍量)或2.8μl(2倍量)的葡糖淀粉酶(Nagase Chemtex制造；商品名为XL-4)加入1ml的糖基化反应溶液中。其后在45℃下将混合物培养3或4小时。培养后，通过HPLC分析法确定溶液中葡萄糖和麦芽糖的含量。在HPLC分析法中，使用LiChrosorb NH2(Merck；4.0×250mm)柱，其中流动相为25∶75的水和乙腈的混合物，流速为1.0ml/min，柱温为40℃。通过RI检测器检测洗脱物中的葡萄糖和麦芽糖。通过HPLC分析法检测洗脱物中氢醌和氢醌苷的量。在HPLC分析法中，使用LiChrospher 100RP18(Merck；4.0×250mm)柱，其中流动相为80∶19.7∶0.3(v/v)的水、甲醇和磷酸的混合物，流速为0.5ml/min，柱温为40℃.通过紫外分光光度法检测洗脱物中氢醌和氢醌苷的量。基于所得氢醌和氢醌苷(HQG)的量计算氢醌糖基化率。结果列在下表8中。

　　甚至使用1倍量的葡糖淀粉酶进行糖降解3或4小时时，酶反应溶液也具有与加入葡糖淀粉酶之前基本上相同的组成。因此说明，使用1倍的葡糖淀粉酶时，延长反应约一或二小时不可能显著地减少麦芽糖的量。

　　另外，甚至增加葡糖淀粉酶的量也不会显著改变糖基化率。这表明，葡糖淀粉酶能够降解糊精，而不降解所希望的产物氢醌苷。因此发现，对于促进糊精降解，增加葡糖淀粉酶的量比延长降解反应时间更有效。

　　接下来研究各种葡糖淀粉酶处理的不同对THF处理的影响。将1ml(XL-4)处理溶液和1ml THF混合在一起，随后使用分液漏斗剧烈振荡1分钟。振荡后将混合物静置1小时。结果混合物分成两相。回收水相。向水相中加入水至1ml。使用水相通过HPLC分析法测定葡萄糖和麦芽糖的量。在HPLC分析法中，使用LiChrosorb NH2(Merck；4.0×250mm)柱，其中流动相为25∶75的水和乙腈的混合物，流速为1.0ml/min，柱温为40℃。通过RI检测器检测洗脱物中的葡萄糖和麦芽糖。通过HPLC分析法检测洗脱物中氢醌和氢醌苷的量。在HPLC分析法中，使用LiChrospher 100RP18(Merck；4.0×250mm)柱，其中流动相为80∶19.7∶0.3(v/v)的水、甲醇和磷酸的混合物，流速为0.5ml/min，柱温为40℃。通过紫外分光光度法测定洗脱物中氢醌和氢醌苷的量。基于所得结果和上述葡萄糖浓度，计算用THF萃取前的麦芽糖浓度和HQG浓度，以及进入THF相的萃取率。结果列在下表9中。

　　结果证实，通过葡糖淀粉酶处理增加葡萄糖浓度的同时，往往抑制了葡萄糖被萃取进入THF相。

　　也证实了这样的趋势，即被加到样品中的葡糖淀粉酶的量越多，则与THF一起振荡并分离后回收的水相的体积就越小(转入四氢呋喃相的水量就越小)。

　　首先，制备包含42％葡萄糖和9％氢醌苷的水溶液。顺序地用水稀释该水溶液来制备葡萄糖浓度为40％到20％的水溶液。当然，稀释该水溶液时，不仅稀释了葡萄糖而且也稀释了氢醌苷。将5ml的THF加入5ml的所制备的水溶液中，随后在30℃使用混合器强烈搅拌5分钟。搅拌后，将混合物在3000rpm下离心分离5分钟。回收上层的相。在葡萄糖浓度降低时，四氢呋喃相的量减少了。当葡萄糖浓度是20％时，通过单次萃取操作不发生相分离。再次将5ml的THF加入下层相中，然后类似地回收上层相。将由该水溶液得到的两个上层相加在一起。通过HPLC分析法测定葡萄糖和麦芽糖的含量。在HPLC分析法中，使用LiChrosorb NH2(Merck；4.0×250mm)柱，其中流动相为25∶75的水和乙腈的混合物，流速为1.0ml/min，柱温为40℃。通过RI检测器检测洗脱物中的葡萄糖和麦芽糖。通过HPLC分析法检测洗脱物中氢醌和氢醌苷的量。在HPLC分析法中，使用LiChrospher 100RP18(Merck；4.0×250mm)柱，其中流动相为80∶19.7∶0.3(v/v)的水、甲醇和磷酸的混合物，流速为0.5ml/min，柱温为40℃。通过紫外分光光度法测定洗脱物中氢醌和氢醌苷的量。

　　结果显示在图1中。如图1所示，氢醌苷的转移速率并不是很依赖于葡萄糖的浓度。相反，随葡萄糖浓度增加葡萄糖的转移速率降低。因此发现，如果萃取中使用的水溶液的糖浓度增加，糖向极性有机溶剂相的转移将小于含疏水基的水溶性有机化合物的转移，由此能够得到高纯度的含疏水基的水溶性有机化合物。

　　如上述实施例18所示，人们发现如果水溶液的糖浓度增加，糖向有机相的转移受到抑制，从而使含疏水基的水溶性有机化合物有效地转入有机相中。因此证实，无论是否浓缩包含含疏水基的水溶性有机化合物的酶反应溶液，都抑制了糖向有机相的转移，使得含疏水基的水溶性有机化合物的提取效率增加。

　　用5N的氢氧化钠水溶液将溶解有35％糊精(PINE-DEX #1，其中DE为7-9；Matsutani Chemical Industry Co.，Ltd.制造)和15％氢醌的水溶液调节为pH6.5。将糖基化酶(淀粉酶X-23，描述在日本公开专利6-277053中)加入该水溶液中，浓度为20单元/ml。因此，在45℃下培养40小时，发生氢醌糖基化反应。反应结束后将2.1μl(1.5倍量)的葡糖淀粉酶(Nagase Chemtex制造：商品名为XL-4)加入每毫升的糖基化反应溶液中。其后在45℃下进行4小时葡糖淀粉酶处理，由此得到反应溶液。

　　通过蒸发器将5ml反应溶液凝缩为体积的80％(4.0ml)或70％(3.5ml)。将等体积THF加入未浓缩的反应溶液、80％浓缩物或70％浓缩物中，随后使用混合器强烈振荡1分钟。在30℃的条件下进行萃取。将混合物静置1小时。该混合物分成两相。回收上面的THF相。如上所述通过HPLC分析得到的THF相中葡萄糖、麦芽糖和氢醌苷的含量。将以下步骤再重复两次：再次将等于水相0.5倍量的THF加入下层水相中，振荡，萃取，然后回收上层THF相。将得到的THF相合并在一起。注意，尽管在相分离的过程中在浓缩物中产生了中间层，但是该中间层被归入水相中。结果列在下表10-12中。

　　结果正如所预料的那样，在浓缩了葡糖淀粉酶后处理反应溶液后进行THF萃取能够抑制萃取进入THF相的葡萄糖的量，使其为从未浓缩的溶液中萃取时的约50-60％。

　　如实施例17所述，使用THF萃取糖基化反应溶液时，即使葡萄糖浓度不超过20％水相也能与有机相完全分离，并且THF相大于水相。另一方面，在上述实施例18中，用水将含有42％葡萄糖和9％氢醌苷的溶液(基本不含氢醌)稀释至葡萄糖浓度为20％时，尽管加入了THF也不能使相分离。因此，要研究含疏水基的水溶性有机化合物对于相分离的影响。

　　将氢醌加入在上述实施例18中制备的含20％葡萄糖的稀释物中，使浓度为10％，由此得到水溶液。向该水溶液中加入等体积的THF，随后使用混合器搅拌5分钟。此后将该混合物静置1小时。结果，THF相与水相完全分离。另外，水混合进入THF相，导致THF相大于水相。回收THF相。如上所述通过HPLC测定THF中的氢醌苷含量。结果发现，萃取出的氢醌苷的量多于不加入氢醌时的情况。据信原因是通过向水相中加入能很好溶于THF相的物质如氢醌，就不容易使THF转入水相，以致分离更有效，并且高浓度的氢醌溶于THF使得氢醌促进苷的转移。

　　先用5N的氢氧化钠水溶液将溶解有35％糊精(PINE-DEX #1，其中DE为7-9；Matsutani Chemical Industry Co.，Ltd.制造)和15％氢醌的水溶液调节为pH6.5。将糖基化酶(淀粉酶X-23，描述在日本公开专利6-277053中)加入该水溶液中，浓度为20单元/ml。其后，在45℃下培养40小时，发生氢醌糖基化反应。反应结束后将2.1μl(1.5倍量)的葡糖淀粉酶(Nagase Chemtex制造：商品名为XL-4)加入每个1毫升的糖基化反应溶液中。其后在45℃下将该混合物培养4小时，由此得到葡糖淀粉酶后处理反应溶液。

　　将5ml的THF加入5ml葡糖淀粉酶后处理反应溶液中，随后使用混合器在3、10、22或45℃下搅拌5分钟。其后以3000rpm的转速将该混合物离心分离5分钟。结果混合物分成两相。回收水相。向该水相中加入水至体积为5ml，得到水溶液。调整后如上所述通过HPLC测定该水溶液的氢醌、氢醌苷和葡萄糖浓度。

　　从表13和图2可以看出，当萃取温度低时，大量糖转入THF相中。当温度增加时，氢醌、氢醌苷和葡萄糖向THF相的转移率降低。其原因被认为是由于HQG和葡萄糖在水相中的溶解度随温度升高而增加，使得向THF相的转移降低。另外，温度越高，氢醌苷和葡萄糖转移率之间的差值就越大。

　　根据本发明提供了一种萃取含疏水基的水溶性有机化合物的方法。本发明的萃取方法和提纯方法能被用作从各种动植物中萃取和提纯有效成分的技术，或用作从各种酶反应溶液中萃取和提纯有效成分的技术。根据本发明的方法能够很容易地并廉价地分离和提纯含疏水基的水溶性有机化合物。

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　　一种萃取含疏水基的水溶性有机化合物的方法，包括以下步骤：使包含含疏水基的水溶性有机化合物和糖的水溶液与极性有机溶剂接触，获得水相与有机相，由此使含疏水基的水溶性有机化合物转入有机相中。水溶液的糖浓度可以是每100ml水溶液至少12g糖。该水溶液还可以包含相分离助剂。相分离助剂选自氯化钠、柠檬酸钠、硫酸镁和硫酸铵。。