第三章 萃取分离法。第二节 双水相萃取。一、双水相萃取简介。常用的溶液萃取法能用来提取生物大分子如蛋白质吗？。大部分萃取采用一个是水相，另一个是有机相，蛋白质遇到有机溶剂，易变性失活。有些蛋白质有极强地亲水性，不能溶于有机溶剂。通常的溶剂萃取法应用于提取生物大分子是有困难的；但双水相萃取法含水量高，接近生理的环境中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性。。双水相系统：因两种水溶性聚合物的水溶液，

　　第三章萃取分离法第二节双水相萃取一、双水相萃取简介常用的溶液萃取法能用来提取生物大分子如蛋白质吗？大部分萃取采用一个是水相，另一个是有机相，蛋白质遇到有机溶剂，易变性失活。有些蛋白质有极强地亲水性，不能溶于有机溶剂。通常的溶剂萃取法应用于提取生物大分子是有困难的；但双水相萃取法含水量高，接近生理的环境中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性。双水相系统：因两种水溶性聚合物的水溶液，或一种水溶性聚合物水溶液与盐溶液混合时的不相容性而形成有明显界面的两相系统。双水相萃取(Aqueoustwo-phaseextraction)是利用物质在互不相溶的两个水相之间分配系数的差异实现分离的方法。葡聚糖（Dextran）与聚乙二醇（PEG）按一定比例与水混合，溶液混浊，静置平衡后，分成互不相溶的两相，上相富含PEG，下相富含葡聚糖，见下图：二、双水相萃取的发展历史1896年荷兰微生物学家Berjerinck发现琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合时形成双水相现象。1956年瑞典Lund大学的Albertsson教授及其同事开始对双水相系统进行比较系统研究。测定了许多双水相系统的相图，考察了蛋白质、核酸、病毒、细胞及细胞颗粒在双水相中的分配行为，为双水相萃取系统的发展奠定了基础。只局限于实验室内的测定和理论研究。Kula教授研究小组对双水相的应用、工艺流程、操作参数、工程设备、成本分析等进行了大量研究，在应用上获得成功。1978年首先将双水相萃取技术用于酶的大规模分离纯化，建成了一套工业装置，达到20kg/h的处理能力，分离纯化了几十种酶，也应用于基因工程产品的分离。双水相萃取可分离多肽、蛋白质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器、细胞组织，以及重金属离子等，近年来，还应用于一些小分子，如抗生素、氨基酸和植物的有效成分等的分离纯化。作为反应系统用于酶反应，生物转化，发酵的产物生产与分离的集成三、双水相系统及成相机理双聚合物双水相体系两种水溶性聚合物溶液混合，形成单一相还是两相，主要取决于两种因素：系统熵的增加，熵的增加与分子数目有关，而与分子大小无关；分子间的作用力，分子之间的相互作用力可看作分子中各基团相互作用力之和，随分子量的增加而增加。分子量大的聚合物以摩尔计的相互作用能超过混合熵的增加而起主导作用，进而决定聚合物溶液混合发生的现象。当两种聚合物之间互不相容，而排斥，它们的线团结构无法互相渗透，导致一种分子为同种分子所包围，在达到平衡后，形成了互不相容的各自富含单一种聚合物的两相。高聚物/无机盐双水相体系某些水溶性聚合物溶液与某些盐溶液混合，两者浓度达到一定值时，也会分为两相，形成聚合物-盐双水相系统。机理不清楚。一种解释为„盐析‟作用。无机盐和简单的有机盐均可，其成相相对能力与其盐析能力次序基本一致。阴离子作用比阳离子重要。多原子离子比单原子离子更有效，成相浓度低。大而电荷密度低的单原子阴离子容易与PEG分子中的氧偶极子发生作用，成相浓度高，无法使用。但它们可以作为中性盐添加组分加入聚合物/聚合物和聚合物/盐系统中，用于改变分配系数。对于聚合物/盐系统，因盐比葡聚糖便宜得多，使得聚乙二醇(PEG)/盐系统具有工业上应用优势。PEG聚乙二醇(polyethyleneglycol)非离子型的水溶性聚合物，环氧乙烷与水或乙二醇逐步加成聚合而成。PEG-400、600、800。无毒、无刺激性，具有良好的水溶性，并与许多有机物组份有良好的相溶性。它们具有优良的润滑性、保湿性、分散性、粘接剂、抗静电剂及柔软剂等，在化妆品、制药、化纤、橡胶、塑料、造纸、油漆、电镀、农药、金属加工及食品加工等行业中均有着极为广泛的应用。DX葡聚糖(dextran)四、常见的双水相体系两者均为非离子性聚合物；B：种非离子性聚合物，另一种为带电荷的聚电解质；C：两者均为聚电解质；D：一种聚合物，另一种为盐；E：一种聚合物，另一种为有机小分子双聚合物的双水相系统：一般认为,只要两种聚合物水溶液的水溶性有所差异,混合时就可发生相分离,并且水溶性差别越大,相分离倾向也就越大。聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dextran，DEX),聚乙二醇/聚乙烯醇,聚乙烯醇/甲基纤维素,聚丙二醇/葡聚糖，聚丙二醇/甲氧基聚乙二醇等。聚合物-低相对分子量化合物体系：PEG/磷酸钾、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠、PEG/葡萄糖等。上相富含PEG,下相富含无机盐或葡萄糖。与一般的水一有机溶剂体系相比较,双水相体系中两相的性质差别(如密度和折射率等)较小。折射率差别甚小,有时甚至都难于发现它们的相界面。两相间的界面张力也很小,仅为10-5～10-4(一般体系为10-3～210-2五、双水相相平衡关系水溶性两相的形成条件和定量关系可以用相图表示，上图为PEG/DEX体系相图。这两种聚合物都能与水无限混合，当它们的组成在图中曲线的上方时(用M点表示)体系就会分成两相，在曲线下方时体系为单一的均相。当分成两相时，则分别有不同的组成和密度，轻相或称上相组成用点表示。由图可见，上相主要含PEG，下相主要含Dextran。C点位临界点，曲线TCB称为结线，直线TMB称为系线。结线上方是两相区，下方是单相区。系线反映的信息杠杆规则：系线上各点均为分成组成相同，而体积不同的两相。两相体积近似服从杠杆规则性质差异：系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大；反之则越小.临界点(criticalpoint)：当系线长度趋于零时,两相差别消失,任何溶质在两相中的分配系数均为1。如K当生物物质进入双水相体系后，在上相和下相间进行选择性分配，表现出一定的分配系数。该分配系数在很大浓度范围内与浓度无关，而与被分离物质本身的性质及特定的双水相体系性质有关。不同的物质在特定体系中有着不同的分配系数。六、影响物质分配平衡的因素聚合物及其分子量的影响不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水性，水溶液中聚合物的疏水性按下列次序递增:葡萄糖硫酸盐甲基葡萄糖葡萄糖羟丙基葡聚糖甲基纤维素聚乙烯醇同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加，其大小的选择依赖于萃取过程的目的和方向，在PEG/DEX系统中，蛋白质的分配系数随着DEX相对分子量的增加而增加。若想在上相获得较高的蛋白质收率，对于PEG聚合物，应降低它的平均分子量，相反，若想在下相获得较高的蛋白质收率，则平均分子量应增加。pH值的影响改变两相的电位差如体系pH值与蛋白质的等电点相差越大，则蛋白质在两相中分配越不均匀。pH值的变化也会影响磷酸盐的离解程度，导致组成体系的物质电性发生变化，也会使被分离物质的电荷发生改变，从而影响分配的进行。离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响在双水相聚合物系统中，加入电解质时，其阴阳离子在两相间会有不同的分配。同时，由于电中性的约束，存在一穿过相界面的电势差(Donnan电势)，它是影响荷电大分子，如蛋白质和核酸等分配的主要因素。同样，对于粒子迁移也有相 似的影响，粒子因迁移而在界面上积累。故只要设法改变界面电势，就能控制蛋 白质等电荷大分子转入某一相。 温度的影响分配系数对温度的变化不敏感 成相聚合物对蛋白质有稳定化作用，所以室温操作活性收率依然很高，而且室温 时粘度较冷却时(4) 低，有助于相的分离并节省了能源开支。 七、双水相萃取的特点 双水相萃取是一种可以利用较为简单的设备，并在温和条件下进行简单的操作就 可获得较高收率和纯度的新型分离技术。 与一些传统的分离方法相比，双水相萃取技术具有以下特点。 易于放大。Albertson证明分配系数仅与分离体积有关, 各种参数可以按比 例放大而产物收率并不降低，这是其他过程无法比拟的。这一点对于工业应用尤 为有利。 分离迅速。双水相系统(特别是聚合物/无机盐系统)分相时间短，传质过程和平衡过程速度均很快，因此相对于某些分离过程来说，能耗较低，而且可以实现 快速分离。 条件温和。由于双水相的界面张力大大低于有机溶剂与水相之间的界面张力，整个操作过程可以在室温下进行，因而有助于保持生物活性和强化相际传质。既 可以直接在双水相系统中进行生物转化以消除产物抑制，又有利于实现反应与分 离技术的耦合。 步骤简便。大量液体杂质能够与所有固体物质同时除去，与其他常用的固液分离方法相比，双水相分配技术可以省去 个分离步骤，使整个分离过程更为经济。 变通性强。由于双水相系统受影响的因素复杂，从某种意义上说可以采取多种手段来提高选择性或收率。 不足之处：易乳化、成相聚合物的成本较高、分离效率不高。 改进与温度诱导相分离、磁场作用、超声波作用、气溶胶技术等实现集成化,改善了 双水相分配技术中诸如成相聚合物回收困难、相分离时间较长、易乳化等问题。 与亲和沉淀、高效层析等新型生化分离技术实现过程集成,充分融合了双方的优 势,既提高了分离效率,又简化了分离流程。在生物转化、化学渗透释放和电泳等 中引入双水相分配,给已有的技术赋予了新的内涵,为新分离过程的诞生提供了新 的思路。 八、应用 蛋白质、酶的纯化(三步双水相分离)第一步：所选择的条件应使蛋白质产物分配在富 PEG 的上相中, 而细胞碎片及 杂质蛋白质等进入下相。 第二步：分相后上相中再加入盐使再次形成双水相体系，核酸和多糖则分配入富 盐的下相，杂质、蛋白质也进入下相，而所需的蛋白质再次进入富含 PEG 第三步：向分相后的上相中加入盐以再一次形成双水相体系。在这一步中，要使得蛋白质进入富盐的下相，以与大量的PEG 分开。蛋白质与盐及PEG 的分离可 以用超滤、层析、离心等技术。 双水相萃取分析黄毒苷的免疫测定。7.稀有金属/贵金属分离，克服溶剂萃取法的不足。 九、聚合物的去除 双水相系统萃取，如果最后一步产物分配在富含PEG 的上相中，通常是加入盐， 形成新的PEG/盐系统，控制条件，使酶转入含盐的下相，分相回收PEG。含酶 下相水溶液还含盐和少量 PEG，PEG 的存在对于某些用处的酶并无妨碍；除盐 和少量 PEG，可采用超滤方法。因双水相选用的 PEG 分子量一般不超过 6000 道尔顿，若酶分子量为几万道尔顿，可选用截留分子量为1 万的超滤膜进行除盐 PEG。但因溶液黏度较高，超滤速度低，往往需要先稀释再超滤，以便提高超滤速度。 若提取的酶在于富含葡聚糖的下相中，也可以采用超滤方法，因在 PEG/Dex 水相系统中使用的葡聚糖分子量高于4万，超滤可将小于3 万分子量的酶分离。 双水相系统的最大特点是对蛋白质的容量高，可达到40g 蛋白质/L 双水相系统， 即使达到100g 蛋白质/L，其黏度也比较适当。1000kg 的细胞破碎物可生产30kg 的蛋白质，只需 300L 的双水相系统，简单的机械混合和沉降，液-液分离设备， 在10min 内就可以完成全过程。 第三节 凝胶萃取 一、凝胶的分类及特性 凝胶是化学键交联的高聚物溶胀体，就其化学组成而言，通常可分成三大类：疏水性有机凝胶； 亲水性有机凝胶； 非溶胀性的无机凝胶。 2.亲水性有机凝胶具有两大特性 凝胶的胀缩特性，即具有交联网络的聚合物凝胶，能吸收比自身重量大数十倍 乃至数百倍的溶剂而溶胀。对于一种溶液，凝胶对各组分的分子大小选择性地吸