一、固相萃取基本原理与操作1、固相萃取吸附剂与目标化合物之间的作用机理固相萃取主要通过目标物与吸附剂之间的以下作用力来保留）疏水作用力：如C18、C8ca、苯基柱等）离子交换作用：SAX,SCX，COOH、NH值对固相萃取的影响pH值可以改变目标物阴离子交换柱来讲，因为吸附剂本身是完全离子化的状态，目标物必须完全离子化才可以保证其被吸附剂完全吸附保留。pH值有关。如对于弱碱性化合物来讲，其而目标物的离子化程度则与pH值必须小于其pKa阳离子个单位才可以保证目标物完全离子化，而对于弱酸性化合物，其必须大于其pKa值两个单位才能保证其完全离子化。对于弱阴交换柱来讲，必须要保证吸附剂完全离子化才保证目标物的完全吸附，而溶液的pH值必须满足一定的条件才能保证其完全离子化。3、固相萃取操作步骤及注意事项针对填料保留机理的不同（填料保留目标化合物或保留杂质），操作稍有不同。1）填料保留目标化合物固相萃取操作一般有四步（见图除去小柱内的杂质并创造一定的溶剂环境。（注意整个过程不要使小柱干涸）将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在1ml/min为宜，最大不超过5ml/min全抽干）淋洗用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。（注意流速不要过快，以1ml/min2）填料保留杂质固相萃取操作一般有三步（见图除去柱子内的杂质并创造一定的溶剂环境。（注意整个过程不要使小柱干涸）将样品转移入柱，此时大部分目标化合物会随样品基液流出，杂质被保留在柱上，故此步骤要开始收集（注意流速不要过快）用小体积的溶剂将组分淋洗下来并收集，合并收集液。（注意流速不要过快）此种情况多用于食品或农残分析中去除色素。二、固相萃取方法的建立与优化固相萃取技术使用起来虽然比液液萃取简单，但建立一个固相萃取的方法并无快捷方式可走。建立固相萃取方法必须考虑与萃取过程相关的多种因素，归纳起来可通过下图来了解：方法建立如下图片1、初步固相萃取方法的建立建立初步的萃取方法要考虑选择合适的SPE选择合适的固相萃取方法方法的优化2、固相萃取柱的选择1）柱填料的选择首选根据目标化合物与干扰物的差异，如极性，分子量，pka值等，选择合适的填料。2）固相萃取柱规格的选择对于反相、正相和吸附型固相萃取柱来说，被萃取样品的质量不吸附容量不同）SPE柱填料的5%（参考值，同一种SPE柱对不同的目标物选择性不同，0cm=0cm0cm?0pt?

　　离子交换型的固相萃取柱，必须考虑离子交换的容量。家的小柱离子交换容量稍有差异。下表附SPE小柱的容量和洗脱参数SPE柱上样容量和洗脱体积的选择规格100mg/1mL200mg/3mL500mg/6mL1g/6mL最大上样量5mg10mg25mg50mg最小洗脱体积250μ1.2mL2.4mL3、选择合适的固相萃取方法固相萃取的保留机制可分为两种：吸附剂（填料）保留目标化合物：绝大多数化合物应用此机制，填料保留其目标组分及少量杂质，通过淋洗步骤去除吸附在柱上的少量杂质，最后选择合适的（洗脱）分洗脱下来。溶剂把目标组根据吸附剂的保留机理可进一步分为：）反相（C18,C8,CN,Phenyl,C4,C1淋洗：含0-50%极性溶剂的缓冲溶液淋洗杂质ca,Flor,Diol,NH分析物：中等极性到强极性基质：非极性至中等极性洗脱：非极性有机溶剂如下图片：活化：用于非极性有机溶剂中的样品时，可用样品溶剂来活化；在用于极性溶剂中的样品时，可用水溶性有机溶剂过柱后，洗脱：洗脱溶液然后用水平衡，最后再用适当pH值的缓冲溶液进行平衡。pKa两个单位（以保证其带电荷pHpKa两个单位（中和分析物的电荷）活化：用于非极性有机溶剂中的样品时，可用样品溶剂来活化；在用于极性溶剂中的样品时，可用水溶性有机溶剂活化后，然后用水平衡，最后再用适当pH值的缓冲溶液进行平衡。上样：样品溶液pHpKa两个单位（以保证其带电荷洗脱：洗脱溶液pHpKa两个单位（中和分析物的电荷）。吸附剂（填料）保留杂质：食品中色素等杂质的去除多用此机制。填料保留杂质而不保留或只保留极少量的目标组分，所以上样后即开始收集目标组分，最后用目标物所在的溶剂进一步洗脱。合并两部分收集液。）洗脱：用样品所在的有机溶剂进一步洗脱，收集流出液。合并上样和洗脱流出液。4、固相萃取方法的优化1）影响萃取效率的因素核心选择合适的SPE柱是保证理想结果的前提。采用正相固定相时，溶剂强度随其极性增强而增加；采用反相固定相时，溶剂强度随极性减弱而增强。离子交换固定相、被分析物和干扰物质的定相带电荷，被分析物带相反电荷，干扰物质带相反电荷，而使被分析物不带电荷。pKa各不相同。通过调节pH大小，可以使固而使干扰物质不带电荷；或者反过来，使固定相带电荷，）操作：控制合适的流速、活化的时不要让柱干涸等2）常见问题及解决方法分析物回收率低萃取重现性差洗脱馏分中含有干扰物SPE柱流速降低或阻塞具体解决方案如下：未被洗脱或部分洗脱？首先要把上样液、淋洗液、洗脱液均收集，进样分析，确定问题来源回收率差如下图片相关图片如下：举例说明参考文献方法用C18柱做相关药物的净化，过柱方法如下：分别用乙酸乙酯、甲醇和水活化小柱，然后把处理过的样品过柱（溶剂为具一定pH值得缓冲溶液），水淋洗小柱后，用乙酸乙酯洗脱目标物。结果：接受液混浊状，回收率和重现性都不理想，可能是什么原因呢？答案：正确的做法是要在淋洗过程结束后把小柱完全抽干。原因有二，其一因为淋洗溶剂（水）与洗脱溶剂（乙酸乙酯）不互溶，如果不抽干洗脱溶剂与目标物不能充分作用，所以造成回收率和重现性都没有保证，同时从外观上看接受液是液混浊液；其二如果淋洗过程不抽干小柱，洗脱溶剂里会引入水（淋洗剂），对下一步浓缩造成很大的困难。相关图片如下：500ml水样过滤，待过CleanerPEP柱（相当于WatersHLB）净化5mL四氢呋喃洗柱子，除掉杂质5mL甲醇1mL/min活化柱子5mL纯水1mL/min活化柱）500mL的水样以5mL/min的速度过柱）5mL纯水2mL/min淋洗）小柱线mL/min淋洗，弃去淋洗液）3mL四氢呋喃1mL/min的速度洗脱柱子，收集洗脱液浓缩定容至结果：回收率不理想，请问此方法有何问题？3mL液相检测。答案：因为目标物灭草松呈酸性，法是样品在过柱之前一定要调节水样的pKa=3.3，而选择的小柱PEP是极性的。所以正确的做pH值小于等于，使目标物分子化，以保证目标物的现象，从而造成回收率差。能被小柱充分保留，否则在上柱的过程中容易造成三、固相技术应用实例解析1、食品领域应用1）动物组织中盐酸克仑特罗等实验材料1.1固相萃取小柱：PCX(150mg/6mL)1.2四种激动剂药物：盐酸克仑特罗、沙丁胺醇、西马特罗、莱克多巴胺等剂药物。 试样的制备取猪肝空白样品，经过液液萃取初步处理后，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加试样。 净化依次用甲醇 5mL 30mmol/L盐酸 5mL 润洗固相萃取小柱， 将上述备用液过柱， 4%氨化甲醇 5mL 洗脱 PCX 小柱，收集洗 1mL/min 50下氮气吹干。在样液过柱和洗脱过程中流速控制在 依次用水 5mL 、甲醇 5mL 淋洗，真空抽干，用 脱液于具塞玻璃试管中， 左右。 衍生化及检测将上述盛有残渣的具塞玻璃试管放入 和双三甲基硅基三氟乙酰胺（ 温烘箱中加热 50烘箱中加热片刻，除去水分后，加入甲苯 100mL 80 100mL，涡旋振荡 20s ，密封玻璃塞，置于 300mL 甲苯，作为试样溶液，供气相色谱 DA-5MS,30m 0.25mm 0.25 ，P/N:1525-3002 结果5.1 回收率实验（精密度和准确度） 将猪肝空白样品经过液液萃取初步处理后，分别添加一定量的标准溶液，配制 次平行实验，猪肝中实验结果列表如下 0.750.67 平均回收值 0.720.70 0.78 1.62 1.66 0.72 72.40 5.93 1.601.61 1.64 4.02 4.10 1.63 81.30 1.23 4.274.38 4.43 8.24 8.35 4.24 84.80 4.16 10 8.77 8.62 8.25 90.24 87.15 8.45 84.45 2.81 100 91.77 92.62 93.95 9.12 91.15 2.86 5.2 重复性实验（批间误差实验）： 猪肝中实验结果列表如下 添加浓度（ 平均回收率 72.40RSD% 平均 回收 5.9381.30 3.49 RSD% 平均回收 84.806.16 RSD% 平均回收率 84.45RSD% 10 平均 回收率 91.15RSD% 100 3.59 2.86 平均值RSD% 75.37 70.09 76.73 73.65 12.95 6.12

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