糖尿病是一种由多种原因引起的代谢紊乱性疾病，主要是由于体内的胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗导致血糖过高或过低，其显著特点是长期高血糖。现已有几类降糖药可用于治疗糖尿病。但它们具有共同的副作用，即体重增加和低血糖，这使得长期治疗无法控制最佳血糖。因此，为改善治疗效果，降低副作用，出现了治疗II型糖尿病的新方法。其中，二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂是目前比较新颖且有前途的抗糖尿病药物。

　　DPP-4又称T细胞表面抗原CD26，是广泛存在于细胞膜上的一类具有潜在的调节免疫、内分泌以及神经系统等功能的膜结合丝氨酸蛋白酶，其存在于多种器官中且家族成员众多，在肠道中高表达，于肝脏、胰腺、胎盘、胸腺等处也有表达，部分以可溶形式存在于循环血液中。目前市场上DPP-4抑制剂类药物多为列汀类，但是据一些药物上市后的检测结果显示，西格列汀可引起严重的过敏反应以及出血性或坏死性急性胰腺炎；维格列汀有肝毒性报道。因此，列汀类DPP-4抑制剂的长期安全性仍然需要更多的临床研究来评价。寻找天然来源的DPP-4抑制剂被提上日程。

　　乳酸菌作为定居肠道中的有益菌群具有多种生理功能，如缓解乳糖不耐受症、改善便秘和腹泻、维持肠道微生态平衡和肠管机能、增强免疫功能和抗肿瘤、影响心血管疾病的发展、缓解过敏反应等。近年来，一些研究报道乳酸菌还具有抑制DPP-4和α-葡萄糖苷酶的作用，因而已经成为控制糖尿病、缓解高血糖和增加胰岛素敏感性的潜在新型和天然治疗药物。山西农业大学食品科学与工程学院的董杰、朱俊玲*和中国农业科学院农产品加工研究所的吕加平*等人的目的是筛选出1 株对DPP-4有良好抑制作用的乳酸菌，并用多种方法对乳酸菌的代谢物进行分离纯化，最终鉴定出乳酸菌代谢物中抑制DPP-4的主要物质，为以后实施代谢调控提供理论基础和参考。

　　结果显示，阳性对照组对DPP-4的抑制率最高，为32.33%；除菌株1.6970外，其余菌株的CFE均对DPP-4有较弱的抑制作用，抑制活性最强的为菌株1.1881，但抑制活性仅为9.5%左右。6 株菌株的CFS对DPP-4均具有抑制活性，而且除菌株1.6970外其余菌株的CFS抑制率都比其CFE的抑制率高；其中植物乳杆菌BLP12的抑制率最高，抑制率为27%左右，其次是ST-2；对于菌株1.6970不论是CFS还是CFE其抑制率都是最低的，所以选择其作为抑制活性最高菌株BLP12的对照菌株。本实验所选菌株的CFS中具有良好的DPP-4抑制能力；而CFE中不含或含有极少的该类抑制物，所以选取BLP12的CFS做下一步的研究。

　　从图1可以看出，对于植物乳杆菌1.6970，本实验所选用的有机溶剂的萃取液对DPP-4均有抑制活性，其中甲醇、丙酮、乙酸乙酯萃取液水相部分对DPP-4的抑制活性较高，而且均高于原液；石油醚萃取液水相部分和有机相部分、乙酸乙酯萃取液有机相部分的抑制活性低于原液，石油醚萃取液水相部分对DPP-4的抑制活性最弱，抑制率仅有3%左右；对于植物乳杆菌BLP12，除石油醚外其他有机溶剂的萃取液对DPP-4均有抑制作用，其中乙酸乙酯萃取液水相部分对DPP-4的抑制活性最高，显著高于原液，抑制率高达50%左右；其次是丙酮萃取液，抑制率为27%左右；甲醇、乙酸乙酯萃取液有机相部分的抑制活性均低于原液；石油醚萃取液对DPP-4没有抑制作用，反而有促进作用。

　　通过图1可以看出，植物乳杆菌BLP12的乙酸乙酯萃取液水相部分对DPP-4的抑制活性最高，所以最终选择乙酸乙酯作为萃取剂。

　　结果显示，样品经过不同分子质量的分级后，所得部分的抑制率均有所下降。植物乳杆菌1.6970不同分子质量大小的CFS对DPP-4均具有抑制活性，其中分子质量小于5 kDa的样品抑制活性最强，分子质量大于10 kDa和5～10 kDa的样品的抑制活性较弱，因此推测具有DPP-4抑制作用的物质分子质量小于5 kDa。

　　植物乳杆菌BLP12不同分子质量大小的CFS对DPP-4均具有抑制活性，而且均比1.6970的抑制活性高；分子质量小于5 kDa的CFS的抑制活性远大于分子质量5～10kDa，因此，推测植物乳杆菌BLP12的CFS中抑制DPP-4的活性物质主要为小于5 kDa的物质。

　　将超滤后分子质量小于5 kDa的溶液进行收集，并利用Superdex peptide层析柱对样品进行进一步分离纯化。从图3可以看出，植物乳杆菌1.6970分出9 个组分，BLP12分出10 个组分，对每个组分进行收集，并标记1.6970的9 个组分为A-1～A-9，BLP12的10 个组分为B-1～B-10。测定各个组分的DPP-4抑制活性。

　　结果显示，植物乳杆菌1.6970的所有组分对DPP-4均具有抑制活性，但抑制活性都较弱，其中抑制活性较高的有A-4，经过2 次柱子的稀释后仍具有14%抑制率。对于BLP12菌株，收集到的10 个组分均具有抑制活性，且每个组分的抑制活性都较高，其中组分B-5的抑制活性最高，抑制率高达46%，比原液的抑制率高19%；其次是组分B-9，抑制率为37%。所以最终选择植物乳杆菌BLP12的组分B-5和组分B-9进行下一步的分离纯化。

　　将样品B-5和B-9用半制备高效液相色谱进行进一步分分离纯化，如图5所示，B-5分离出4 个组分，分别记为B-5-1、B-5-2、B-5-3、B-5-4；B-9分离出2 个组分，分别记为B-9-1和B-9-2。对分离得到各个组分进行收集并测定对DPP-4的抑制率，以便选择最终进行质谱鉴定的样品。

　　结果显示，组分B-9-1的抑制活性很低，组分B-9-2没有抑制活性；B-5经分离得到的4 个组分除B-5-4外，其余组分都有较弱的抑制活性，B-5-3的抑制活性最高，抑制率为8%左右。尽管组分B-5-3的抑制活性最高，但是由于样品经过多次分离纯化，已经被稀释很多倍，样品中可以抑制DPP-4的活性物质含量已十分稀少，所以在进行下一步的质谱鉴定前，将样品用冷冻浓缩机进行浓缩。

　　植物乳杆菌BLP12的细胞代谢物经分离纯化后用高效液相色谱-质谱联用仪鉴定代谢物中的物质种类，共鉴定出61 种物质。

　　本研究测定6 株益生菌的细胞代谢物和细胞内容物的DPP-4抑制作用，结果显示植物乳杆菌BLP12的细胞代谢物对DPP-4的抑制效果最为显著，将BLP12的代谢物进行分离纯化并用高效液相色谱-质谱联用仪检测样品中物质种类，最终得到61 种物质，经查证其中11 种物质与治疗糖尿病相关，其中有4 种DPP-4抑制剂，其余7 种与治疗糖尿病相关物质。这11 种物质分别是十二烷基硫酸盐、烟酸、环(苯丙氨酸-脯氨酸)、亮氨酸脯氨酸、十二烷二酸、吡啶羧酸、十八碳三烯酸、别嘌呤醇、鸟嘌呤、邻苯三酚、曲酸。

　　从植物乳杆菌BLP12的代谢物中分离出的这些物质充分说明，植物乳杆菌不仅具有抑制DPP-4的作用，还可以通过其他多种方式改善糖尿病的症状。

　　本文《乳酸菌代谢物中二肽基肽酶-4抑制剂的分离纯化及鉴定》来源于《食品科学》2020年41卷8期116-122页，作者：董杰，刘鹭，甲承立，朱俊玲，吕加平。DOI:10.7506/spkx0411-138。

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