本发明涉及天然物质的选择性萃取方法，更具体地，涉及通过诱导物理乳化来快速溶解和增溶天然产物中的选择性成分(非极性/极性、难溶性/水溶性、hlb)或物质并萃取和浓缩/分离的技术，涉及利用溶解-乳化萃取法(dissolution-emulsionextract，dee)的天然物质的选择性萃取方法。

　　萃取(extraction)是指用溶剂溶解并分离固体或液体形态的原料中所包含的成分，作为常规的萃取方法，当原料为固体时，使用固-液萃取方法，当原料为液体时，使用液-液萃取方法。

　　液-液萃取方法(liquid-liquidextraction；lle)是将溶剂应用于包含溶质的液体混合物中，从而将混合物中的特定成分与其他成分分离。

　　为了萃取天然物质内的非极性物质，一般使用液-液萃取方法，在液-液萃取中，如己烷(hexane)、三氯甲烷(methanedichloride)、乙酸乙酯(ethylacetate)等非极性溶剂毒性很强，而且需要经过重复多次萃取过程和用于去除非极性溶剂的干燥过程，因此效率低而复杂，工艺漫长，萃取效率低，并且随着工艺时间的延长存在生产成本高的问题。

　　例如，在从鹅不食草(centipedaminima)萃取布雷维林a(brevilina)的过程中，用甲醇经多次萃取原料，然后通过在萃取液中混合己烷并分馏多次、混合三氯甲烷并分馏多次、混合乙酸乙酯并分馏多次以及混合丁醇并分馏多次来萃取，萃取时，在300g干燥重量的鹅不食草中萃取出约25mg布雷维林a(brevilina)，其萃取量甚少，效率非常低。(非专利文献1)

　　用其他萃取方法实验的结果表明，当萃取树脂时，萃取效率较低，当萃取皂化/未皂化时，无法萃取或萃取效率非常低。

　　专利文献1中公开了鹅不食草的萃取物，其中使用超临界二氧化碳萃取法萃取天然物质，但是这种萃取法具有使用条件复杂、萃取时间长、萃取效率也非常低的问题。

　　因此，有必要开发一种能够容易且有效地从天然产物等中萃取具有非极性的天然物质并易于使用其萃取物的新颖的萃取方法。

　　根据本发明一实施例的天然物质的选择性萃取方法，包括如下步骤：通过萃取天然产物原料来制备初级萃取液、通过在初级萃取液中混合包含亲脂性增溶剂和水的相分离组合物来进行次级萃取，以及通过分离经过相分离的溶液的上层来得到天然物质。

　　另外，根据本发明一实施例，上述经过相分离的溶液的上层可以包含亲脂性增溶剂以及非极性天然物质。

　　此外，根据本发明一实施例，上述非极性天然物质可以包含布雷维林a(brevilina)或其衍生物。

　　此外，根据本发明一实施例，上述非极性天然物质可以阻止或抑制jak-stat信号传导过程。

　　此外，根据本发明一实施例，上述天然产物原料可以包含选自由鹅不食草(centipedaminima)、山金车(arnica)属植物以及堆心菊(helenium)属植物组成的组中的一种以上。

　　此外，根据本发明一实施例，在次级萃取的步骤中，可以混合10重量百分比至90重量百分比的上述相分离组合物以及10重量百分比至90重量百分比的上述初级萃取液。

　　此外，根据本发明一实施例，上述相分离组合物还可以包含70重量百分比以下的非离子型表面活性剂。

　　根据本发明另一实施例的天然物质的选择性萃取方法，包括如下步骤：利用包含亲脂性增溶剂和水的相分离组合物从天然产物原料制备经过相分离的萃取液，以及通过分离经过相分离的溶液的上层来得到非极性天然物质。

　　本发明的实施例涉及从野生草等的原料萃取天然物质的方法，尤其可以利用溶解-乳化萃取法(dissolution-emulsionextract，dee)高效且相对容易地萃取非极性天然物质。

　　另外，由于不使用采用毒性溶剂的液-液萃取法，可以省略干燥等步骤，而且溶剂是对人体无害的物质，因此将包含天然物质的萃取液分离后，可立即用作产品无需其他步骤，并且因微乳化或临界胶束浓度，可以增加产品的吸收率。

　　图5为用于说明利用根据本发明实施例的相分离组合物相分离萃取液的状态的照片。

　　图6为拍摄根据本发明实施例的相分离状态的照片(左)以及通过分离上层并添加混合辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(labrasol)来微乳化的最终处方的照片(右)。

　　图7为用于说明将根据本发明实施例的初级萃取液连续稀释(serialdilution)后，利用相分离组合物进行相分离的状态的照片。

　　图9至图14为示出当男性使用根据本发明实施例制备的生发剂18天时的脱发量以及生发量的变化的图。

　　图15至图17为示出当女性使用根据本发明实施例制备的生发剂18天时的脱发量以及生发量的变化的图。

　　根据本发明一实施例的天然物质的选择性萃取方法，包括如下步骤：通过萃取天然产物原料来制备初级萃取液、通过在初级萃取液中混合包含亲脂性增溶剂和水的相分离组合物来进行次级萃取，以及通过分离经过相分离的溶液的上层来得到天然物质。

　　以下，根据本发明实施例的非极性天然物质的萃取方法，对萃取的天然物质及其用途等进行说明。

　　在此之前，本说明书中所使用的全部术语仅用于描述特定实施例，而非限制本发明。并且，这里使用的单数形式还包括复数形式，除非有语句清楚地表示与其相反的含义。此外，在本说明书中使用的“包括”或“包含”的含义是指将特定特性、区域、整数、步骤、操作、元素或成分具体化，而不是排除其他特定特性、区域、整数、步骤、操作、元素或成分的附加。

　　本发明中，第一、第二等术语用于说明各种组分，上述术语仅用于将一个组分与其他组分区分。

　　此外，在本说明书中使用的术语仅用于说明示例性的实施例，而非限制本发明。除非上下文另有明确规定，单数的表述包括复数的表述。本说明书中，应当理解的是，“包括”、“具备”、“具有”的术语是指定实施的特征、数字、步骤、组分或其组合的存在，而非预先排除一个或其以上的其他特征、数字、步骤、组分或其组合的存在或者附加可能性。

　　本发明可以有各种修改和各种形式，下面将详细说明和示例特定实施例。然而，这并不意味着将本发明以特性的公开形式限制，而应当理解为包括本发明的精神以及技术范围内的所用修改、等同物及代替物。

　　在本发明中，天然物质的萃取方法称为非极性天然物质的溶解-乳化萃取法(dissolution-emulsionextract，dee)。

　　根据本发明实施例的非极性天然物质的萃取方法，包括如下步骤：通过萃取天然产物原料来制备初级萃取液、在初级萃取液中混合包含亲脂性增溶剂和水的相分离组合物，以及通过分离经过相分离的溶液的上层来得到非极性天然物质。

　　根据溶解-乳化萃取法，通过萃取天然产物原料内的非极性天然物质并混合相分离组合物来溶解和乳化，再通过相分离萃取非极性天然物质。

　　图1a为用于说明根据本发明一实施例的天然物质的选择性萃取方法的图。图1b为用于说明关于作为现有天然物质的萃取方法的液-液萃取方法的图。

　　图1为用于说明根据本发明一实施例的天然物质的选择性萃取方法的图。图2为用于说明关于作为现有天然物质的萃取方法的液-液萃取方法的图。

　　如上所述，为了萃取天然物质内的非极性物质，一般使用液-液萃取方法，在液-液萃取中，溶剂使用己烷(hexane)、三氯甲烷(methanedichloride)、乙酸乙酯(ethylacetate)等非极性溶剂，毒性很强，并且萃取过程复杂，萃取效率低，从而具有生产成本高、工艺漫长的问题。

　　首先，将天然产物原料用水清洗并干燥。此时，例如，为了提高天然物质的萃取率，可以将干燥的原料粉碎并以制备粉末。

　　在本发明实施例中使用的天然产物原料为鹅不食草，购入并使用槐山药草有机农产品合作社(https：kr)生产的韩国产石胡荽(，鹅不食草，永川)。

　　例如，上述天然产物原料，尤其鹅不食草包含作为非极性天然物质的布雷维林a或其衍生物。从鹅不食草萃取的非极性天然物质包含布雷维林a和各种其衍生物的化合物。

　　作为从鹅不食草萃取的有效成分的上述非极性天然物质可以阻止或抑制jak-stat信号传导过程。

　　即，布雷维林a阻止和抑制jak-stat信号传导，从而对类风湿关节炎等自身免疫性疾病有效。

　　纵观文献，布雷维林a是鹅不食草的主要成分，主要利用布雷维林a进行抗癌活性的研究，但是缺乏对脱发及毛发生长的研究。

　　例如，布雷维林a阻止或抑制jak-stat信号传导过程，从而可以对以下疾病的治疗有效：包括感冒、疥疮、糖尿病、明目、白苔、鼻塞、鼻炎、疮肿、哮喘、鼻窦炎、皮炎、疟疾、咳嗽、解热以及百日咳(儿科疾病)，并包括类风湿关节炎、癌或肿瘤的自身免疫性疾病；以及壮年性脱发、继发性脱发、斑秃、精神性脱发、溢脂性脱发、拔毛癖、恶性脱发、女性型脱发、男性型脱发、雄激素性脱发、休止期脱发、头癣、全秃、少毛症、遗传性脱发或全身秃等自身免疫性疾病。

　　例如，上述非极性天然物质包括下述化合物中的一种以上，这表示布雷维林a及其衍生物的化学纯构(p.wuetal./phytochemistry76(2012)133-140)。

　　萃取溶剂可以选用水、醇等各种溶剂，本发明中使用的是醇。优选地，可以使用甲醇、乙醇。

　　例如，萃取可以使用热水萃取法、冷浸萃取法、回流冷却萃取法、溶剂萃取法、水蒸气蒸馏法、超声波萃取法、熔融法等方法中的一种，此外，可以进行常规的分馏工艺。

　　根据本发明实施例的萃取可以通过将天然产物原料浸入醇中，在100℃以上的温度下热水萃取约一小时，醇可以使用约80％的醇。例如，天然产物原料可以使用鹅不食草本身，或者可以使用经过粉碎后的粉末。

　　例如，可以选择性地进行通过由热水萃取的初级萃取液减压浓缩来去除醇成分的的步骤。即使利用未经浓缩步骤的初级萃取液直接进入下一步骤，实现本发明也没有差异，但是在更清楚的相分离及萃取效率方面，优选去除不必要的醇成分。

　　用400ml的80％乙醇对10g鹅不食草干草进行热水萃取并对380mg萃取液进行分析，结果确认到萃取液中包含26mg布雷维林a(相对于干草的含量为0.26％)。

　　图3为用于说明根据本发明一实施例的相分离组合物的组成比的三相状态图。图4为用于说明根据本发明实施例的相分离组合物的组成的图。图5为用于说明利用根据本发明实施例的相分离组合物相分离萃取液的状态的照片。图8为用于说明根据本发明一实施例的相分离组合物的举动的图。

　　上述相分离组合物可以包括亲脂性增溶剂和水。例如，上述相分离组合物可以包含10重量百分比至90重量百分比的亲脂性增溶剂以及10重量百分比至90重量百分比的水。

　　例如，上述相分离组合物还可以包括非离子型表面活性剂。上述相分离组合物可以包括40重量百分比以下的非离子型表面活性剂。

　　参照图3及图4，图3示出根据本发明的相分离组合物的成分在混合液中出现的状态，这表示溶液的状态根据亲脂性增溶剂、非离子型表面活性剂以及水的组成比变化为相分离(phaseseparation)、微乳液(microemulsion)、乳液(emulsion)。图3中，中链甘油三酯(labrafao)是亲脂性增溶剂中的一种，labrasol是非离子型表面活性剂中的一种。

　　基于图3的三相状态图，根据待相分离区域的组成比，设定本发明的相分离组合物的组成比。根据本发明实施例的相分离组合物表现出通过与特定物质混合而在没有乳化的情况下层彼此分离的性质。

　　因此，天然产物原料内所包含的非极性天然物质经初级萃取后，与相分离组合物混合，使亲脂性增溶剂和非极性天然物质包含在一个层，其余的水及其他成分包含在另一个层，从而发生相分离。

　　本发明的实施例涉及通过诱导物理乳化来快速溶解和增溶天然产物中的选择性成分(非极性/极性、难溶性/水溶性、hlb)或物质并萃取和浓缩/分离的技术，涉及利用溶解-乳化萃取法(dissolution-emulsionextract，dee)的天然物质的选择性萃取方法，利用其从混合非极性/极性物质、难溶性/水溶性物质或者具有高hlb/低hlb的物质的混合物中，可以选择性地萃取具有一种性质的物质，或者与其相反地去除。

　　在本发明实施例中，当上述相分离组合物包含非离子型表面活性剂时，在混合上述相分离组合物的步骤中，可以在升温的同时将其混合以实现更清楚的相分离。例如，可以将相分离组合物与初级萃取液混合的混合物保持在30℃至50℃温度的同时将其搅拌，优选地保持在35℃至45℃温度的同时将其搅拌。

　　图8为用于说明根据本发明一实施例的相分离组合物的举动的图。参照图8，如果将初级萃取液和上述相分离组合物混合，布雷维林a及其衍生物，即非极性天然物质被萃取溶解于非离子型表面活性剂至亲脂性增溶剂。此时，当进行额外的高速混合时，混合物内的表面活性剂及增溶剂的表面积增加，同时未萃取或未溶解的部分非极性天然物质大部分被溶解，从而达到瞬间性的临界胶束浓度(criticalmicelleconcentration；cmc)状态，此时，当混合液的温度升高达到浊点(cloudpoint)时，与离子型表面活性剂不同的是，非离子型表面活性剂的溶解度随着温度的升高而降低，因此更加清楚地表现出混合液的相分离。

　　尤其，升温并相分离的方法中，亲水亲油平衡(hlb，hydrophile-lipophilebalance)值较高的非离子型表面活性剂，例如，添加hlb值为12以上的labrasol等时，可以有利地起作用。

　　通过分离经过相分离的溶液的上层来得到非极性天然物质。将经过相分离的溶液静置规定时间后，利用离心分离机过滤。

　　与上述不同，根据本发明另一实施例的天然物质的选择性萃取方法，包括如下步骤：利用包含亲脂性增溶剂及水的相分离组合物从天然产物原料制备经过相分离的萃取液，以及通过分离经过相分离的溶液的上层来得到非极性天然物质。

　　即，上述实施例使用通过在天然产物原料中混合溶剂和相分离组合物来萃取的单一步骤进行萃取及分离，而非通过萃取天然产物原料来制备初级萃取液后，混合并分离经过相分离组合物的两个步骤。这样，萃取时，可以缩短萃取工艺步骤及时间。

　　包含根据上述方法萃取的非极性天然物质的相分离层中额外地混合超出上述相分离组合物范围的且在微乳液范围的乳化组合物，可以制备乳化的产品。

　　根据本发明实施例，由于萃取的天然物质及包含其的组合物等产品不使用采用毒性溶剂的液-液萃取法，可以省略干燥等步骤，而且溶剂是对人体无害的物质，因此将包含天然物质的萃取液分离后，可立即用作产品无需其他步骤，并且因微乳化或临界胶束浓度(cmc)，可以增加产品的吸收率。

　　一般情况下，表面活性剂的使用通过表面活性剂的cmc来提高化合物的溶解度，从而增加吸收率，除了提高微乳液和溶解，还可以通过减小要吸收的物质的大小来增加吸收位点的吸收率。

　　像这样制备的产品，可以以生发剂、润发精、发乳，营养发乳、洗发水、护发素、煽油膏，发霜，营养发霜、润发霜，按摩发霜、发蜡、头发定型剂、发膜、营养发膜、洗发皂、泡沫洗发露、护发油、毛发干燥剂、护发处理剂、染发剂、烫发剂、漂发剂、发胶、发釉、美发剂、粘发剂、润发露、摩丝、头发喷雾等产品；以及作为皮肤外用剂的霜剂、凝胶剂、贴剂、喷雾剂、软膏剂、硬膏剂、乳液剂、搽剂、糊剂、巴布剂等剂型配制，并且可以以液状、固体状及气体状适当使用。

　　像这样的产品对可应用布雷维林a及其衍生物的效果的各种疾病的改善有效，例如，可以对以下疾病的治疗有效：感冒、疥疮、糖尿病、明目、白苔、鼻塞、鼻炎、疮肿、哮喘、鼻窦炎、皮炎、疟疾、咳嗽、解热以及百日咳(儿科疾病)，并包括类风湿关节炎、狼疮、癌或肿瘤的自身免疫性疾病；以及壮年性脱发、继发性脱发、斑秃、精神性脱发、溢脂性脱发、拔毛癖、恶性脱发、女性型脱发、男性型脱发、雄激素性脱发、休止期脱发、头癣、全秃、少毛症、遗传性脱发或全身秃等自身免疫性疾病。

　　以下，通过关于本发明的非极性天然物质的萃取方法的实施例进行更详细的说明。

　　在本发明的萃取方法中，热水萃取天然产物原料，在萃取液中混合相分离组合物并相分离后，分离一部分层，从而得到非极性天然物质。

　　天然产物原料为鹅不食草，购入槐山药草有机农产品合作社(https：//natural-herb.co.kr)生产的韩国产石胡荽(鹅不食草，永川)，清洗干燥。

　　用400ml的80％乙醇对10g鹅不食草干草进行热水萃取，获得初级萃取液。之后，通过减压浓缩初级萃取液来去除乙醇。

　　根据下述表1的组成比，将减压浓缩的初级萃取液及相分离组合物混合后，搅拌10分钟。下述表1是与图4的组合物对应的组成的说明。l1对应于实施例1，l2对应于实施例2，以下相同。

　　之后，静置60分钟后，分离经过相分离的上层液。观察上述相分离的混合液的结果示于图5中，图5是示出发生相分离的实施例8、19、29的混合液的照片。

　　用400ml的80％乙醇对10g鹅不食草干草进行热水萃取并用hplc对380mg萃取液进行分析，确认到萃取液中包含26mg布雷维林a(相对于干草的含量为0.26％)。

　　天然产物原料为鹅不食草，购入槐山药草有机农产品合作社(https：//natural-herb.co.kr)生产的韩国产石胡荽(鹅不食草，永川)，清洗干燥。

　　用250ml的80％乙醇对10g鹅不食草干草进行热水萃取，获得初级萃取液。过滤(filter)初级萃取液后，蒸发干燥，获得0.82g萃取物。

　　其中，去除己烷分馏层后，在剩余的水层萃取物中混合20ml三氯甲烷(mc)，放入分液漏斗(separatingfunnel)，分离三氯甲烷(mc)层。然后，重复3次，浓缩所得的三氯甲烷(mc)层，用hplc进行分析。

　　其中，去除三氯甲烷(mc)分馏层后，在剩余的水层萃取物中混合20ml乙酸乙酯(etac)，放入分液漏斗(separatingfunnel)，分离乙酸乙酯(etac)层。然后，重复3次，浓缩所得的乙酸乙酯(etac)层，用hplc进行分析。

　　其中，去除乙酸乙酯(etac)分馏层后，在剩余的水层萃取物中混合20ml丁醇(n-buoh)，放入分液漏斗(separatingfunnel)，分离丁醇(n-buoh)层。然后，重复3次，浓缩所得的丁醇(n-buoh)层，用hplc进行分析。

　　其中，去除丁醇(n-buoh)分馏层后，浓缩剩余的水层，用hplc进行分析。

　　天然产物原料为鹅不食草，购入槐山药草有机农产品合作社(https：//natural-herb.co.kr)生产的韩国产石胡荽(鹅不食草，永川)，清洗干燥。

　　用250ml的80％乙醇对10g鹅不食草干草进行热水萃取，获得初级萃取液。过滤初级萃取液后，蒸发干燥，将30ml水和1g树脂(hp-20)混合，用漩涡混匀仪搅拌1分钟，在250rpm下培养(incubation)1小时。之后，通过离心分离，分离初级上清液(包含水)后，在剩余的树脂中混合3ml乙醇。再次通过离心分离，分离次级上清液(包含乙醇)。将每个分离的上清液浓缩，重悬于等量的乙醇中，利用针头式过滤器(syringefilter)过滤后，用hplc进行分析。

　　将根据上述实施例32分离的上层液(次级萃取液)浓缩(升温自然浓缩)至不超过添加的亲脂性增溶剂体积的120％，将5glabrasol作为乳化组合物混合至浓缩的上层液以制备微乳液。由此，制备出12mg/ml微乳液(microemulsion)、8.5ml、95％收率的滋补制剂。这种乳液作为水基而非有机溶剂，包含安全的赋形剂，可以单独用于软膏、滋补品等各种形式的产品，无需额外的工艺(制备例1)。

　　图6为拍摄根据本发明实施例的相分离状态的照片(左)以及通过分离上层并添加混合labrasol来微乳化的最终处方的照片(右)。图6的左侧照片是示出根据上述实施例32相分离的初级萃取液的照片，图6的右侧照片是示出根据上述制备例1制备的滋补制剂的照片。

　　另一方面，在根据上述实施例32分离的上层液(次级萃取液)中混合作为乳化组合物的0.3mllabrasol及0.5mllabrafac以进行微乳化(制备例2)。另一方面，在根据上述实施例32分离的上层液(次级萃取液)中混合0.3mllabrasol作为乳化组合物以进行微乳化(制备例3)。另一方面，在根据上述实施例32分离的上层液(次级萃取液)中混合0.1mllabrafac作为乳化组合物以进行微乳化(制备例4)。另一方面，在根据上述实施例32分离的上层液(次级萃取液)中混合0.5mllabrasol及0.5mllabrafac作为乳化组合物以进行微乳化(制备例5)。另一方面，混合0.8mllabrasol及0.2mllabrafac作为乳化组合物以进行微乳化(制备例6)。这种乳化组合物超出图3及图4的相分离组合物的范围，可以在与图3的微乳液(microemulsion)对应的范围适当应用。

　　图7为用于说明将根据本发明实施例的初级萃取液连续稀释(serialdilution)后，利用相分离组合物进行相分离的状态的照片。

　　从各种浓度的初级萃取物中进行次级萃取(溶解乳液萃取或基于脂质的药物(fr.)萃取系统(dissolutionemulsionextractorlipid-baseddrug(fr.)extractsystems.))时，无论浓度和数量如何，可以根据亲脂性增溶剂(lipdssulubilizer)选择性地浓缩并分离萃取布雷维林a及其衍生物，而且照片用于说明具有更适合微量萃取法的性能的状态。

　　本发明的相分离组合物可以萃取萃取液中所包含的所有天然物质，实质上，与初级萃取液中所包含的待萃取的非极性天然物质的浓度无关。即，可以用于高效萃取或去除极微量的物质。图7示出根据实施例32萃取初级萃取液后连续稀释(serialdilution)而无需浓缩，再通过将相分离组合物混合到各自中来相分离的结果。即，虽然待萃取的非极性天然物质的浓度降低，与其相同或相似的相分离的区域减少，但发现通过相分离可以分离期望的物质。残留在水果、蔬菜等的农药大部分是非极性(难溶性/亲油性)的，这不仅难洗，而且沉积在植物的纤维质上。为了去除残留在这些植物上的农药，可以使用上述相分离组合物。

　　一般男性及女性使用根据上述制备例1制备的生发剂一段时间后，测定脱发量以及生发量的变化。生发剂的使用方法是根据使用人员的状态将头发清洗干净后直接涂抹在头皮上。其中，由于脱发量很难准确测定，因此，用淋浴后脱落的头发根数来判断，而生发量由毛发诊断期测定的同一区域的毛发密度来判断。

　　图9为示出当男性使用根据本发明实施例制备的生发剂18天时的脱发量的变化的曲线为示出当男性使用根据本发明实施例制备的生发剂18天时的脱发量以及生发量的变化的图。图15为示出当女性根据本发明实施例制备的生发剂18天时的脱发量的变化的曲线为示出当女性根据本发明实施例制备的生发剂18天时的脱发量以及生发量的变化的图。

　　参照图9至图17，可以看出，随着使用规定量的生发剂，脱发量逐渐减少，并且在实验期间随着停止使用，脱发量有所增加。特别是在女性实验者的情况下，如图10所示，大部分定期使用规定量以上的生发剂，结果发现脱发量持续减少。在图10至图14、图16及图17中可以发现男性和女性实验者的生发量均增加，毛发密度增加约15％以上至20％以上。额外地，4周后观察脱发量的调和平均数，可以确认最初脱发量为10根至150根的实验者在4周后的脱发量的调和平均数稳定到50根至60根。

　　以上，说明了本发明的示例性实施例，但本发明不限于此，本领域普通技术人员将理解，在不脱离所述权利要求的概念和范围的情况下，可以进行各种修改和变形。

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