二噁英属于多氯取代的芳香烃族化合物，是多氯代二苯并-对-二噁英（PCDDs）、多氯代二苯并呋喃（PCDFs）和共平面多氯联苯的统称。其中，2,3,7,8-四氯代苯并二噁英（TCDD）是迄今为止发现毒性最强的化合物，比氰化钾要毒100倍以上；TCDD已经被世界卫生组织判定为一级致癌物，具有生殖毒性、神经毒性、内分泌毒性和免疫毒性效应等。二噁英类物质毒性的另一个特点是，二噁英为脂溶性化合物，易积累在生物体的脂肪组织中，不易被降解和排出，可以在人和动物体内不断蓄积达到较高浓度，在生物体表现出明显的症状之前有一个漫长的潜伏过程。

　　二噁英分析属于超痕量、多组分分析，其分析测定必须具备有效的提取和净化技术、异构体的高效分离定性定量、良好的质量管理等技术条件。且同位素稀释内标法是国际上通用的测定食品、饲料及环境样品中二噁英质量浓度的方法。自2014年6月起，气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）成为欧盟委员会（EU）规程2017/644中的一项确证方法。鉴于此，长沙海关技术中心，食品安全科学技术湖南省重点实验室的陆静、焦艳娜、付善良*等人拟对猪肉基质中的二噁英相关检测前处理方法进行探讨和优化，开发一种适合肉类食品中PCDD/Fs和DL-PCBs检测的GC-MS/MS方法，对推动和保障动物源性食品的顺利出口具有重要意义。

　　先称取1g的猪脂肪溶于5 mL的环己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶液中，考察脂肪的出峰时间，见图2a。再于5 mL的环己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶液中加入5 ng的DL-PCBs，考察目标物的出峰时间，见图2b。最后于含有猪脂肪的5 mL环己烷-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶液中加入5 ng DL-PCBs，考察目标物的收集时间段，见图2c。如图2所示，猪脂肪出峰时间为4～7.5 min，杂质峰出峰时间为7.5～10 min，DL-PCBs出峰时间为9.5～13 min，因此目标物的收集时间为8～13 min，则凝胶色谱条件为：上样量5 mL，流速5 mL/min，收集8～20 min的组分。

　　取经索氏提取后的猪脂肪2 g，以5 mL的乙酸乙酯-环己烷（1∶1，V/V）溶解，加入DL-PCBs回收率和精密度检查标准溶液， 13 C 12 -DL-PCBs标记的定量内标溶液，用GPC净化除脂，收集8～20 min的组分，得到的GPC净化图（图3）。经旋转蒸发仪浓缩和氮吹浓缩后有约20 μL的肉眼可见油层，然后酸化硅胶净化1 次，浓缩后加入回收率内标溶液，进样测定。回收率情况见图4，DL-PCBs的回收率为88.3%～120.1%，而内标的回收率只有42.1%～48.5%。可见直接以GPC进行除脂净化，色谱柱容易出现饱和状态，目标物出现跟脂肪分子重叠交叉流出的情况，导致脂肪没有完全去除，从而干扰样品的结果测定，同时也说明后续必须以多层硅胶柱、碱性氧化铝柱和活性炭柱进一步净化，以减少基质干扰。

　　取猪脂肪2 g，分别加入PCDD/Fs和DL-PCBs的回收率和精密度检查标准溶液，13C12-PCDD/Fs和13C12-DLPCBs标记的定量内标溶液。先以酸化硅胶除脂3 次，再用GPC除脂，样液浓缩后以净化仪净化，最后浓缩、进样测定。同时取另一份猪脂肪2 g，酸化硅胶除脂3 次后直接以净化仪净化，没有用GPC除脂，其他操作同前。考察各物质的回收率情况见图5。可知，脂肪以酸化硅胶除脂3 次基本能够满足要求，如果再以GPC除一次脂肪，目标物反而有所损失，降低待测物的回收率。因此，实际测定时以酸化硅胶进行除脂操作。

　　前期实验结果发现GPC容易产生饱和现象而不能完全去除脂肪，因此，考察脂肪含量对酸化硅胶以及净化仪除脂时的过载现象。结果发现，当脂肪含量超过5 g时，用酸化硅胶除脂3 次后，虽然再没有出现使硅胶变色的情况（判定酸化硅胶除脂步骤已经完成）。但是经过净化仪净化后，DL-PCBs收集管浓缩后仍有40 μL左右的脂肪层，说明此时酸化硅胶除脂和净化仪除去脂肪部分都出现过载现象。因此，建议称样量（以脂肪计）为2～5 g。

　　将PCDD/Fs和DL-PCBs校正标准溶液分别按浓度由低到高的顺序注入GC-MS/MS中，得到峰面积。以目标物的含量为横坐标，峰面积为纵坐标，根据内标法定量，绘制标准曲线，求出线性相关方程，各物质的线，表明该方法在较宽的浓度范围内色谱峰面积与含量呈较好的线可知，仪器测定时，各化合物的相对保留时间为1.000～1.001，符合国家标准的要求。相对响应因子（RRF）的相对标准偏差（RSD）为3.39%～16.22%，小于20%，符合国家标准对其小于20%的要求。本实验采用添加标准物质的方法获得方法检出限，以空白猪肉为样品进行方法学验证，检出限的测定方法为以工作曲线最低点的浓度加标，然后测定7 组平行样的偏差，其中检出限为3 倍标准差，得到方法检出限，本方法中各目标物的检出限为0.020～0.172 ng/kg。

　　以猪肉为例，进行分析过程的精密度和回收率实验，加入PCDD/Fs和DL-PCBs回收率和精密度标液（GB 5009.205—2013附录B.4（稀释10 倍）和B.11（稀释100 倍））各50 μL，按上述方法进行样品前处理并分析测定。同时将PCDD/F和DL-PCBs校正标准溶液分别按浓度由低到高的顺序注入GC-MS/MS中。以目标物的含量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，根据内标法定量。样品设3 组平行实验，得到的内标回收率结果见表3，目标物的回收率结果见表4。内标的回收率为45.3%～122.4%，RSD为1.0%～14.7%；目标物的回收率为64.9%～118.8%，RSD为1.1%～14.7%。因此，该方法准确可靠，符合标准的要求，可以满足实际猪肉样品中PCDD/Fs和DL-PCBs的测定要求。

　　二噁英检测属于超痕量分析，除了所用的试剂、耗材要保证符合要求外，实验所用的仪器、器皿都容易残留二噁英类物质，实验发现DL-PCBs较PCDD/PCDFs容易残留，这跟环境介质中普遍存在DL-PCBs有关，因而容易对实验过程造成污染。在样品测定前，需要对系统空白进行考察。二噁英检测前处理使用的仪器主要有快速溶剂萃取仪、索氏提取仪、全自动净化仪，以及旋转蒸发仪、氮吹仪等。快速溶剂萃取仪和全自动净化仪在样品测定后进行一次空白溶剂淋洗，基本可以将残留物去除。旋转蒸发仪在使用的过程中避免溶液爆沸；氮吹时避免氮吹针接触样液，且对氮吹管进行有机溶剂超声浸泡和常规清洗，针头现用现装，基本可以避免旋转蒸发仪和氮吹仪的污染。

　　玻璃器皿用完后当天进行清洗，先以洗涤剂进行清洗，自来水冲洗干净后，于超声波清洗器中超声5 min，取出分别以自来水、去离子冲洗干净，自然晾干。然后分别用丙酮、甲苯、正己烷、二氯甲烷各洗一遍，晾干备用。

　　在实验过程中发现，二噁英类化合物的残留主要集中在索氏提取仪，因此对其进行了较详细考察，实验选取索氏提取仪的4 个提取位置为对象。待进行一次常规样品提取后，首先以正己烷-二氯甲烷溶液（1∶1，V/V）加热循环80 次淋洗，浓缩后上机测定（编号分别为1-1、2-1、3-1、4-1），发现DL-PCBs有较高的残留。而PCDD/PCDFs残留较低，符合标准的检测要求。然后分别用丙酮、甲苯、正己烷、二氯甲烷进行洗涤，再以甲苯进行加热循环80 次淋洗，浓缩后上机测定（编号分别为1-2、2-2、3-2、4-2），DL-PCBs残留达到标准的检测要求，同时也说明上述的洗涤方法符合测定要求。具体检测结果见图6，DL-PCBs的残留主要集中在PCB-77、PCB-123、PCB-118、PCB-105、PCB-167、PCB-157、PCB-189这7 种物质，其他5 种物质的残留较少，而同位素标记的化合物残留也较少。因此，在日常检测中，要多关注以上7 种DL-PCBs的残留情况，当考察其在样品的回收率情况时，也要考虑其在实验中的系统空白残留情况。

　　应用本方法对一份送检猪肉样品进行GC-MS/MS方法的检测，同时对其进行分包检测和比对，分包单位采用的检测方法为GB 5009.205—2013，检测仪器为HRGC-HRMS，得到的总毒性当量（TEQ）值为0.319 ng/kg（WHO2005-TEQ-Upperbound），应用本方法得到的总TEQ值为0.363 ng/kg（WHO2005-TEQ-Upperbound），2 种方法得到的总TEQ值偏差为12.9%，小于15%，2种仪器的测定偏差为0.7%～14%。说明该方法检测结果准确，适用于猪肉中二噁英的定性和定量检测。同时应用本方法对市售的4 份猪肉进行二噁英含量测定，结果为0.047 8～0.305 ng/kg（WHO2005-TEQ-Upperbound），符合欧盟的限量要求。

　　对采用GC-MS/MS法测定猪肉样品中PCDD/Fs和DLPCBs的测定步骤进行了方法优化和探讨。猪肉为高脂肪含量样品，对比了GPC和酸化硅胶除脂2 种方式，结果发现，GPC除脂对PCDD/Fs和DL-PCBs的回收率影响较大，且容易存在除脂不完全的现象，后续还需要进一步以酸化硅胶进行除脂，降低了目标物的回收率，因此，酸化硅胶除脂更适合超痕量的二噁英类化合物的分析和检测。高脂肪含量的样品要减少称样量，避免净化步骤出现过饱和现象。实验对系统空白污染也提供了较为详细的探讨，在索氏提取仪的使用过程中要注意DL-PCBs的污染和残留。实验结果表明，该方法的回收率和精密度、RRF、各化合物的方法检出限等参数都符合国家标准要求，方法具有普适性，为保障食品安全提供了很好的技术支持。

　　本文《GC-MS/MS法测定猪肉中二噁英及二噁英类多氯联苯》来源于《食品科学》2023年44卷18期364-371页. 作者：陆静，焦艳娜，成婧，申甜甜，朱绍华，付善良. DOI:10.7506/spkx1108-080. 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

　　实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

　　非热加工专栏：江苏大学邹小波、石吉勇教授等：米糠非热稳定化处理技术研究进展