第四章萃取法 第一节 溶剂萃取法 • 广义的溶剂萃取法(solvent extraction) - - 包括液 固萃取和液 液萃取： 液 固萃取又称浸取、浸提 • -  液-液萃取指用一种溶剂将 物质从另一种溶剂 （如发酵 液）中提取出来的方法。 溶剂萃取法优点： ①操作可连续化，速度快，生产周期短； ②对热敏物质破坏少； ③采用多级萃取时，溶质浓缩倍数大、纯 化度高。 缺点： 由于有机溶剂使用量大，对设备和安全要 求高，需要各项防火防爆等措施。 一、基本概念 （一）萃取与反萃取 被提取的溶液称为料液，其中欲提取的 物质称溶质，而用以进行萃取的溶剂称 为萃取剂(extractant) 达到萃取平衡后，大部分溶质转移到萃 取剂中，这种含有溶质的萃取剂溶液称 为萃取液，而被萃取出溶质以后的料液 称为萃余液。 萃取一般指用有机溶剂将物质从水相转移 到有机相的过程。 反萃取(stripping或back extraction)是将萃 取液与反萃取剂（一般为水溶液）相接触， 使某种被萃入有机相的溶质转入水相的过 程，可看作是萃取的逆过程。 （二）、分配定律 能斯特分配定律：在一定温度、一定压 力下，某一溶质在互不相溶的两种溶剂 间分配时，达到平衡后，在两相中的活 度之比为一常数。如果是稀溶液，可以 用浓度代替活度，即： CL 萃取相浓度 K CR 萃余相浓度 K 称为分配系数 应用分配定律时，须符合下列条件： ①必须是稀溶液，即适用于接近理想溶 液的萃取体系； ②溶质对溶剂的互溶度没有影响； ③溶质在两相中必须是同一分子形式， 即不发生缔合或解离。 在萃取过程中，溶质在两相的分子形式常 常并不相同，仍然采用类似分配定律的公 式作为基本公式。这时候溶质在萃取相和 萃余相中的浓度，实际上是以各种化学形 式进行分配的溶质总浓度，它们的比值以 分配比(distribution ratio)表示： CL CL1 CL2  CL3   CLn D K表 CR CR1 CR2 CR3  CRn （三）、萃取因素 • 萃取因素也称萃取比，其定义为被萃取 溶质进入萃取相的总量与该溶质在萃余 E V 相中总量之比。通常以 表示。若以 和 l V2分别表示萃取相和萃余相的体积，M1 和M2分别表示溶质在萃取相和萃余相中 的平衡浓度。萃取因素（ ）为： E 萃取相中溶质总量 M 1V1 V1 E K表 萃余相中溶质总量 M 2 V2 V2 （四）、分离因素 • 料液中的溶质并非是单一的组分，除了 所需产物（ ）外，还存在有杂质（ ）。 A B (separation factor)  分离因素 ，常用 表示， 其定义为：在同一萃取体系内两种溶质 在同样条件下分配系数的比值 CA 1 / CB 1 KA β CA 2 / CB 2 KB 二、溶剂萃取法的基本原理 • 抗生素在不同的pH条件下，可以有不同 的化学状态，其分配系数亦有差别，若 适度改变pH，可将抗生素自水相转入有 机相，或从有机相再转入水相，这样反 复萃取，可以达到浓缩和提纯的目的 AH 有机相 Ko AH Kp A- + H+ 水相 K 0 K 0 K表 K P 110pH p K P 1 [H ] 三、萃取方法和理论收率的计 算 （一）单级萃取 E 萃取因素 为 萃取相中溶质总量 C1VS VS 1 E K K 萃余相中溶质总量 C2 VF VF m 式中 V ——料液体积；Vs——萃取剂的体 F 积；C ——溶质在萃取液的浓度； C — 1 2 —溶质在萃余相的浓度；K——表观分配 系数； m——浓缩倍数 萃余率： 萃余液中溶质总量 1  100% 100% 原始料液中溶质总量 E 1 理论收率： 1 E 1 1 100% 100% E 1 E 1 例如： 洁霉素在20℃和pH10.0时表观分配系数 （丁醇水）为 。用等量的丁醇萃取料 / 18 液中的洁霉素，计算可得理论收率 18 1 100% 94.7% 181 若改用1/3体积丁醇萃取， 1/ 3 E 18 6 理论收率： 1 6 1 100% 85.7% 6 1 （二）多级错流萃取 萃余率： 1 n 100%      E 1 1 E 2 1  En 1 1 n n 100%   E 1 理论收率  n 1 E 1 1 1 1 100% 100% n  n  n E 1 E 1 红霉素在pH 9.8时的分配系数（醋酸丁酯/ 水）为44.5 ，若用1/2体积的醋酸丁酯进行 单级萃取，则： E 44.5 1/ 2 22.25 理论收率 1 22.25 1 1 100% 95.7% 22.25 1 若用1/2体积的醋酸丁酯进行二级错流萃取， 则 1/ 4 E 1 E 2 44.5  11.125 1  2 理论收率 1 11.1251 1 100% 99.32%    11.1251 11.1251 多级逆流萃取 n级萃取后，萃余率为： E 1  n 1 100% E 1 理论收率为 E 1 E n1 E 1 1 n1 100% n1 100% E 1 E 1 青霉素在0℃和pH2.5时的分配系数（醋酸 / 35 1/4 丁酯 水）为 ，若用 体积的醋酸丁 酯进行二级逆流萃取， 则： 1/ 4 E 35  8.75 1 n 2 ，理论收率  21 8.75 8.75 1 21 100% 98.84%   8.75 1 若改为二级错流萃取，第一级用1/4体积 的醋酸丁酯，第二级用1/10体积的醋酸丁 酯，则 1/ 4 1/ 10 E 1 35  8.75 E 2 35  3.5 1 1 1 1 1 100% 97.72%    8.75 1 3.5 1 第二节 影响溶剂萃取的因素 一、乳化和破乳化 （一）乳状液的形成和稳定条件 乳化剂多为表面活性剂。分子结构特点： 一般是由亲油基和亲水基两部分组成的， 即一端为亲水基团或极性部分，另一端 为疏水性基团或非极性部分（烃链） 。 亲油基 亲水基 ( a ) 乳化剂使乳状液稳定与以下因素有关： （）界面膜形成 1 2 （）界面电荷的影响 3 （）介质黏度 每一种表面活性剂都有亲水和疏水基团， 两种基团的强度的相对关系称为HLB值 hydrophile-lipophile balance （ ）。完全 不亲水（HLB=0）和完全亲水 （ ）的两种极限乳化剂作为标 HLB=20 准，其它表面活性剂的HLB值就处于这 两种极限值之间。 分散性质 HLB 范围 在水中不分散 1~4 分散性不好 3~6 激烈振荡后成乳状液分散 6~8 稳定的乳状液分散 8~10 半透明到透明分散 10~13 透明溶液 13 以上 HLB 值 用途 3~6 W/O 型乳浊液 7~9 润湿剂 8~15 O/W 型乳浊液 13~15 洗涤剂 15~18 助溶剂 （二）、影响乳状液类型的因素 1．相体积的影响 假定分散相为大小均匀的圆球，按紧密地堆积， 圆球体积占总体积的74%。如水的体积占总体 积小于 时，只能形成 ／ 型乳状液；大 26% W O 74% O W 于 时，只能形成 ／ 型乳状液。 2 ．乳化剂分子空间构型的影响 截面积小的一头指向分散相，截面积大的一头 O W 指向分散介质，所以一价金属皂形成 ／ 型 乳状液，而二价金属皂形成 ／ 型乳状液， W O 3．界面张力的影响 乳化剂聚集于界面形成薄膜，若两相界面 张力不等，则使膜弯曲，其凹面一侧为界 面张力较高的相，高界面张力这侧的液体 易形成内相。 4 ．容器壁性质的影响 O W 亲水性强的容器易得 ／ 型乳状液，亲 油性强的容器易形成 ／ 型乳状液。 W O （三）、乳状液的破坏 1、加入表面活性剂 2 、离心 3、加电解质 4 、加热 5、吸附法破乳 6、高压电破乳 7、稀释法 （四）、常用的去乳化剂 1.阳离子表面活性剂 （）十二烷基三甲基溴化铵（ ） 1 1231 CH (CH ) CH (CH ) N+ Br — ［ 3 2 10 2 3 3 ］ 2 PPB （）溴代十五烷吡啶（ ） + N C15H31 Br- 2. 阴离子表面活性剂 阴离子表面活性剂，如亚油酸钠、十二烷 基磺酸钠、石油磺酸钠等 3．其他破乳剂 如用溴代四烷基吡啶作去乳化剂，因其 既易溶于水，又易溶于醋酸丁酯中，既能 W O O W 破坏 ／ 型，也能破坏 ／ 型乳状液， 比PPB破乳完全，用量为0.03%~0.05% 。 它能降低青霉素提取时随废液的损失，提 高收率。 二、pH的影响 1、pH影响弱酸或弱碱性药物的分配系数 2、pH也影响药物的稳定性 例：用醋酸丁酯提取苄基青霉素，在0℃ 、 时测得 ， -2.75 ，可求 pH2.5 K表 =30 K =10 P 得  pH pK P  K 0 K表 110 47 可按下式计算表观分配系数和水相pH的 关系： K 0 47 K表 110pH pK P 110pH 2.75 可得，当pH=4.4时，K表=1。当 pH4.4时，青霉素能被萃取到醋酸丁酯 相中，当pH4.4时，青霉素从醋酸丁酯 相转移到水相，称为反萃取。 三、温度和萃取时间的影响 高温不稳定 高温时溶剂间互溶度增大 四、盐析作用的影响 ①由于盐析剂与水分子结合，降低了药物 在水中的溶解度，使其易转入有机相； ②盐析剂降低有机溶剂在水中的溶解度； ③盐析剂增大萃余相比重，有助于分相。 五、溶剂种类、用量及萃取方式 ①分配系数愈大愈好，若分配系数未知， 则可根据“相似相溶”的原则，选择与药 物结构相近的溶剂； 1 ②选择分离因素大于 的溶剂； ③料液与萃取溶剂的互溶度愈小愈好； ④尽量选择毒性低的溶剂。 ⑤溶剂的化学稳定性高，腐蚀性低，沸 点不宜太高，挥发性要小，价格便宜，来 源方便，便于回收。 如洁霉素20℃ ，pH10.0时，分配系数（丁醇 ／水） ，根据萃取方式理论收得率的计 =18 算方法，得出： 收率（%） 浓缩比（丁醇/水） 单级 二级错流 二级逆流 三级逆流 1 94.7 99.0 99.7 99.98 1/2 90.0 96.7 98.9 99.88 1/3 85.7 93.8 97.7 99.61 1/4 81.8 90.5 96.1 99.14 第三节 萃取过程和溶剂回收 一、混合 1、搅拌罐 2 、管式混合器 喷嘴 扩大管 3、喷嘴式混和器 料液 出 吸入口 图3-10 4 、气流搅拌混和罐 - 二、液 液两相分离 离心机 三、溶液回收 （一）、单组分溶剂回收 简单蒸馏 或精馏 （二）、低浓度溶剂回收 , 先简单蒸馏 后精馏 精馏：塔底102℃，塔顶91℃ ，蒸馏物为恒 沸混和物，含水量为28%-29% ，超过水在醋 酸丁酯中溶解度（20℃ ，1.4%）。 三、回收与水部分互溶并 形成恒沸混和物的溶剂 四、回收完全互溶的混和溶剂 并不形成恒沸混和物 - 如丙酮 丁醇混和溶剂，由于其沸点相差 较大（丙酮沸点为56.1℃，丁醇沸点为 117.4℃），采用精馏方法很易得到纯组 分。如果混和溶剂要反复使用，则不需 要将它们分成纯组分，只需经过蒸馏方 式除去不挥发物质，然后测定混和溶剂 的比例，再添加不足的溶剂使达到要求。 第四节 双水相萃取 双水相萃取技术(two-aqueous phase extraction) ，又称水溶液两相分配技术， 它利用不同的高分子溶液相互混合可产 生两相或多相系统，静置平衡后，分成 互不相溶的两个水相，利用物质在互不相 溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取 的方法，称为双水相萃取法。 特点：能保留产物的活性，操作可连续化， 可纯化蛋白质2~5倍。 一、双水相的形成 如葡聚糖与聚乙二醇按一定比例与水混 合，静置平衡后，分成互不相溶的两个 水相，上相富含PEG ，下相富含葡聚糖 高聚物（P） 高聚物或低聚物（Q） 聚丙二醇 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮， 羟丙基葡聚糖，葡聚糖 聚乙二醇 聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖 甲基纤维素 羟甲基葡聚糖，葡聚糖 乙基羟乙基纤维素 葡聚糖 羟丙基葡聚糖 葡聚糖 聚蔗糖 葡聚糖 聚乙二醇 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒石酸钾钠 二、双水相萃取的基本概念 （一）相图 相图右上部为两相区，左下部为均相区，两相与均 相的分界线叫双节线。组成位于 点的系统实际上 A 由位于 、 两点的两相所组成， 称为系线。 C B BC 当系线向下移动时， 长度逐渐减小，表明 两相的差别减小，当 达到K点时，两相间 差别消失，K点称为 临界点。 （二）分配系数 • 影响分配系数的因素包括很多，如粒子 大小、疏水性、表面电荷、粒子或大分 子的构象等，这些因素微小的变化可导 致分配系数较大的变化，因而双水相萃 K 取有较好的选择性。分配系数 与溶质的 浓度和相体积比无关： C K t C b 三、影响双水相萃取的因素 （一）、成相高聚物的分子量 : 一般原则 对于给定的相系统，如果一种高聚 物被低分子量的同种高聚物所代替，被萃取 , 的大分子物质 如蛋白质、核酸、细胞粒子等， 将有利于在低分子量高聚物一侧分配。 如以Dextran 500(MW 500 000)代 替Dextran 40（MW 40 000）,即 增大下相高聚物的分子量，被萃取 的低分子量物质如细胞色素C分配 系数增加并不显著。然而，被萃取 的大分子量物质，如过氧化氢酶的 分配系数可增大到原来的6~7倍。 （二）成相聚合物浓度 ——界面张力 一般来说，双水相萃取时，如果相系统组成 位于临界点附近，则蛋白质等大分子的分配 系数接近于 。高聚物浓度增加，系统组成偏 1 1 K 离临界点，蛋白质的分配系数也偏离 ，即 ＞ 或 ＜ 1 K 1 （三）、电化学分配 ——盐类的影响 盐对带电大分子的分配影响很大。各种 盐的分配系数存在着微小的差异，产生 了相间电位。由于蛋白质等大分子在水 溶液中常带有电荷，相间电位造成的静 电力能影响所有带电大分子和带电细胞 粒子在两相中的分配。例如，DNA萃取时， 离子组分微小的变化可使DNA从一相几乎 完全转移到另一相。 （四）、疏水效应 • 选择适当的盐组成，相系统的电位差可 以消失。排除了电化学效应后，决定分 配系数的其它因素，如粒子的表面疏水 性能即可占主要地位。成相高聚物的末 端偶联上疏水性基团后，疏水效应会更 加明显，此时，如果被分配的蛋白质具 有疏水性的表面，则它的分配系数会发 生改变。 （五）、温度及其它因素 • 温度的影响是间接的，它主要影响相的高 聚物组成，只有当相系统组成位于临界点 附近时，温度对分配系数才具有较明显的 作用。 • pH对酶的分配系数也有很大关系，特别 是在系统中含有磷酸盐时，如图4-18所示。 由于pH的变化会影响磷酸盐是一氢化物 还是二氢化物磷酸盐的存在，而一氢化物 磷酸盐对界面电位有明显的影响。 • Dextran、FiColl、淀粉、纤维素等高聚物具 , D L 有光学活性 它们应该可以辨别分子的 、 型。因此，对映体分子在上述高聚物相系统 中具有不同的分配特征。同样，一种蛋白质 D L 对 或 型能选择性地结合而富集于一相中， 可将此用于手性分配。例如，在含血清白蛋 D L 白的相系统中， 、 型色氨酸可获得分离。 四、双水相萃取的应用 • 双水相系统平衡时间短，含水量高，界 面张力低，为生物活性物质提供了温和 的分离环境。它还具备操作简便、经济 省时、易于放大。据报道，系统可从 直接放大到 3规模（ 5倍） 而各 10ml 1m 10 , 种试验参数均可按比例放大，产物收率 并不降低。 • 例如PEG-Dextran系统特别适用于从细胞 匀浆液中除去核酸和细胞碎片。系统中 加入0.1mol/L NaCl可使核酸和细胞碎片 Dextran , 转移到下相（ 相） 产物胞内酶位 于上相，分配系数为0.1~1.0 。选择适当 的盐组分，经一步或多步萃取，可获得 满意的分离效果。如果NaCl浓度增大到 2~5mol/L ，几乎所有的蛋白质、酶都转 移到上相，下相富含核酸。 五、双水相萃取技术的发展 （一）、廉价双水相体系的开发 （二）、双水相亲和分配 ( liquid ion （三）、液体离子交换剂 exchanger) 如用PEG6000-(H PO ) 来分离纯化干扰 2 4 4 素时，其分配系数可高达170，而杂蛋白 的分配系数只有 。 值为 ，这 0.04 β 4250 是一般方法所不能达到的。 第五节 反胶束萃取 • 反胶束（reversed micelle ），也称反胶 团或反微团，是表面活性剂分散在连续 的有机相中自发形成的纳米尺度的一种 聚集体。 一、基本原理 • 表面活性剂溶于非极性溶剂中，并使其浓 度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂 内形成聚集体，非极性基团在外，极性基 团则排列在内，形成一个极性核，此极 性核具有溶解极性物质的能力。当含有此 种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接 触后，蛋白质及其他亲水性物质能够溶 于极性核内部的水中，由于周围的水层 和极性基团的保护，蛋白质不与有机溶剂 接触，从而不会造成失活。 二、反胶束体系 • 在反胶束萃取的早期研究中多用季胺盐， AOT 目前用得最多的是 ，其化学名为丁 二酸乙基己基酯 磺酸钠。 - 表面活性剂 有机溶剂 AOT n-烃类（C C ）异辛烷，环己烷，四氯化碳，苯 6~ 10 CTAB 乙醇/异辛烷，己醇/辛烷，三氯甲烷/辛烷 TOMAC 环己烷 Brij60 辛烷 Triton X 己醇/环己烷 磷脂酰胆碱 苯，庚烷 磷脂酰乙醇胺 苯，庚烷 三、反胶束萃取过程 • 反胶束选择性分离目标蛋白质包括两个 : (forward extraction) 过程 萃取过程 和反 萃取过程(backward extraction)。 : • 萃取过程 目标蛋白质从主体溶液转移至 反胶束溶液中的过程； : • 反萃取过程 目标蛋白质从反胶束溶液中 ( 转移至第二水相 或以固体的形式游离出 来 的过程。这些过程可连续操作，反胶 ) 束可在两套系统中循环。 反胶束相 出料 混合器1 分离器1 混合器2 分离器2 进料 前萃取 后萃取 四、影响因素 • 表面活性剂的种类 早期用一种表面活性剂 现在混合体系的 , 研究较多 • 水相pH值 决定蛋白质表面带电基团的离子化状态, 与表面活性剂的头部基团有相互作用. • 温度 , 提高温度可使反胶束排斥水 起浓缩作用 • 离子强度 降低带电蛋白与反胶束极性基团的相互作用, 并导致高离子强度下反胶束颗粒变小 • 亲和反胶束萃取 , 导入亲合配基 提高萃取率和选择性 五、应用举例 （一）蛋白质类药物 如蛋白酶、脂肪酶等 （二）、氨基酸 , ; 亲水性不同 疏水氨基酸主要在反胶束界面 亲 水性氨基酸在反胶束内部极性水中 （三）、抗生素 如胆甾醇-D-丙氨酰胺-D-丙氨酸酯 （四）、核酸 第六节 超临界流体萃取法 • 超临界流体（supercritical fluid ，简称 SCF）萃取技术，又称压力流体萃取、 超临界气体萃取、临界溶剂萃取等，是 临界压力 临界温度 利用处于 和 以上的 一些溶剂流体所具有特异增加物质溶解 能力来进行分离纯化的技术。 一、基本原理 • 当气体物质处于其临界温度(Tc)和临界压 力(Pc)以上时，不会凝缩为液体，只是密 度增大，具有许多特殊的物理化学性质： 的密度接近于液体的密度 粘度接近 • 流体 , , 于气体；在临界点附近 超临界流体的溶解 度对温度和压力的变化非常敏感； 5 3 流体 临界温度（℃） 临界压力（10 Pa） 临界密度g/cm CO 31.06 73.9 0.448 2 SO 157.6 79.8 0.525 2 N O 36.5 72.7 0.451 2 水 374.3 224.0 0.326 氨 132.4 114.3 0.236 苯 288.9 49.5 0.302 甲苯 318.5 41.6 0.292 甲醇 240.5 81.0 0.272 乙烷 —88.7 49.4 0.203 丙烷 —42.1 43.2 0.220 丁烷 10.0 38.5 0.228 戊烷 36.7 34.2 0.232 乙烯 9.9 51.9 0.227 利用CO2作为萃取剂主要有以下优点: (1) 二氧化碳超临界温度(Tc=31.06℃)是所 有溶剂中最接近室温的，可以在35～ 40℃ , 的条件下进行提取 防止热敏性物质 的变质和挥发性物质的逸散。 (2) CO , 在 2气体笼罩下进行萃取 萃取过程中 不发生化学反应 又由于完全隔绝了空气 ; , , 中的氧 因此 萃取物不会因氧化或化学变 化而变质。 (3)由于CO2无味、无臭、无毒、不可燃、 , 价格便宜、纯度高、容易获得 使用相对 安全。 (4)CO , 2是较容易提纯与分离的气体 因此萃 , 取物几乎无溶剂残留 也避免了溶剂对人 体的毒害和对环境的污染。 (5) CO , 2扩散系数大而粘度小 大大节省了 萃取时间 萃取效率高。 , 二、影响超临界流体萃取的因 素 （一）压力的影响 压力增加，绝大多 数化合物溶解度都 急剧上升。 根据萃取压力的变化,可分为3类基本应用: • 一是高压区的全萃取，高压时,SCF的溶解 能力强,可最大限度地溶解大部分组分； • 二是低压临界区的脱臭，在临界点附近, 仅能提取易溶解的组分,或除去有害成分; • 三是中压区的选择萃取，在高低压区之间, 可根据物料萃取的要求,选择适宜压力进 行有效萃取。 （二）温度的影响 • 一个是温度对流体密 度的影响，随温度升 高，CO 流体密度降低， 2 导致其溶剂化效应下 降，对物质的溶解度 也下降； • 另一个是温度对物质 蒸气压的影响，随温 度升高，物质的蒸气 压增大，使物质在CO2 流体中的溶解度增大。 三 、助溶剂 ( ) • 当在CO 流体中加入少量第二溶剂，可以 2 大大提高其对原来溶解度很小的溶质的 溶解能力，这种第二组分溶剂称为辅助 溶剂（entrainer），又称助溶剂。 • 从经验上看，加入极性助溶剂对提高极 性成分的溶解度有帮助，对非极性溶质 作用不大；相反，非极性助溶剂对极性 和非极性溶质都有增加溶解度的效能。 被萃取物 超临界流体 助溶剂 咖啡因 CO 水 2 单甘酯 CO 丙酮 2 亚麻酸 CO 正己烷 2 青霉素G 钾盐 CO 水 2 豆油 CO 己烷，乙醇 2 菜子油 CO 丙烷 2 棕榈油 CO 乙醇 2 EPA，DHA CO 尿素 2 （四）、物料性质的影响 • 物料的粒度影响 细物料可增加传质效果，但过细增加流动阻力 • 细胞破壁 • 水分 含水量过高时，形成 连续性水膜，影响传 质过程 三、超临界萃取的流程 四、在生物制药领域的应用 ⑴ 具有广泛的适应性： ⑵ 萃取效率高，过程易于调节： ⑶ 分离工艺流程简单： ⑷ 有些分离过程可在接近室温下完成 ⑸ 分离过程必须在高压下进行，设备及工 艺技术要求高，投资比较大，普及应用 较为困难。 （一）、提取生物活性物质 植物中提取有效成分，如黄酮、色素等 （二）、超临界流体萃取除杂 去除农药残留等 （三）、超临界流体结晶技术 快速膨胀法：快速降压，物质析出 抗溶剂法：加入超临界流体，降低物质的 溶解度，使之从液体中析出

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