磁性固相萃取-毛细管区带电泳测定生物样本中吡咯并喹呤醌含量的方法，属于生物分析技术领域。

　　卩比咯并喹呤醌(pyrroloquinolinequinine PQQ)是一种新的氧化还原酶辅基,主要分布于原核生物以及部分植物和哺乳动物之中，在牛奶尤其母乳中含量较高，被认为是体内必需的维生素之一。生物样本中PQQ的分析方法有气相色谱-质谱法、高效液相色谱、毛细管电泳法等[文献方法 I:Zdene k Glatz*, Martina Moravcova 1 , Oldr ich Janiczek,Determination of pyrroloquinoline quinone by capillary zone Electrophoresis,Journal of Chromatography B, 739 (2000) 101 - 107.] 毛细管电泳是二十世纪 80 年代发展起来的一种快速分析方法，具有分析速度快、分离效率高、样品和试剂消耗量少的优点。与高效液相色谱法相比，毛细管柱容易清洗、使用寿命长。文献报道的PQQ毛细管电泳检测法是在缓冲体系加入β -丙氨酸，采用反相C18小柱固相萃取分离富集细胞培养基中的PQQ,检出限为0.1 0.2 μ M，PQQ峰型存在拖尾现象，固相萃取所用的C18小柱价格昂贵，而且步骤繁琐，工作量大。近年来，磁纳米固相萃取技术在生物样品制备领域受到广泛关注。由于磁性萃取介质直接分散于样品溶液中，接触面大，对生物样品和液体中含固体悬浮物的样品尤其适合，样品处理简单。本发明采用SiO2与不同极性的吸附剂混合组成，这些吸附剂对疏水性能不同的化合物具有不同的选择性，从而能够有效的进行分离。本方法快速、简便，首次应用磁固相萃取技术结合毛细管电泳测定牛奶中PQQ的含量。本方法采用的毛细管电泳法加入了修饰剂环糊精，首次在毛细管电泳缓冲体系中加入三氟乙酸，解决了毛细管电泳图中峰的拖尾问题。峰的对称性明显好于文献报道。与文献方法对比，分离效率提高了 6倍。

　　本发明的目的在于提供一种磁性固相萃取-毛细管区带电泳测定生物样本中吡咯并喹呤醌含量的方法，使PQQ与其他较难分离的电中性杂质达到高效快速的分离。本发明的技术方案:一种磁性固相萃取-毛细管区带电泳测定生物样本中吡咯并喹呤醌含量的方法:( I)毛细管选择及预处理:选用未涂层的41.5cmX50ym石英毛细管柱； 新毛细管柱先依次用甲醇冲洗IOmin,蒸懼水冲洗5min, lmol/L NaOH溶液冲洗30min,蒸懼水冲洗5min,最后再用运行缓冲液冲洗10-15min ;每次进样前，用蒸馏水及运行缓冲液冲洗2min ；

　　运行缓冲液及样品溶液均用0.22 μ m微孔针头过滤器过滤；(2)毛细管电泳分析条件:检测波长为249nm，进样方式为0.5psi压力进样，进样时间10.0秒，分离电压为25kv，毛细管柱温25°C ；运打缓冲液为:pH=8.8、10mmol/L砸砂_10mmol/L β _环糊精_质量浓度0.1% 二

　　氟乙酸的混合液。(3)生物样本中吡咯并喹呤醌PQQ的检测选用牛奶作为生物样本的典型，①Fe3O4磁性纳米粒子的制备:IOOmLl.25mM FeSO4.7Η2060 下搅拌，用 6Μ NaOH 调 pH 至 10，Ih 后磁性沉淀物分离，用去离子水冲洗，60°C线磁性纳米粒子；②改性的混合磁性功能纳米粒子Fe304-Si02-Phenyl_C8的制备:将制备得到的Fe3O4磁性纳米粒子加入到含ImM四甲氧基硅烷、ImM苯基三甲氧基硅烷和ImM辛基三甲氧基硅烷混合液中，四甲氧基硅烷:苯基三甲氧基硅烷:辛基三甲氧基硅烷体积比1:1:1，加50mL含w/v0.01%吐温-100、w/v0.02%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的v/vl2.5%甲醇和0.3mL w/v25%NH3作催化剂，120°C搅拌回流12 16h，用水、丙酮、正己烷依次清洗多次，60°C线h，得磁性功能纳米粒子Fe304-Si02-Phenyl-C8 ；

　　③牛奶样品去除蛋白ImL牛奶加5mL甲醇，润旋振荡2min,4000rpm离心IOmin,上清液用50mLMcIlvaine buffer缓冲液稀释，以备磁性固相萃取；McIlvaine buffer缓冲液为:ρΗ7.0,0.1M柠檬酸调0.2Μ磷酸氢二钠溶液；④磁性固相萃取称取上述制备好的50mg磁性功能纳米粒子Fe304-Si02-Phenyl_C8于安普瓶中，分别用ImL的甲醇和水活化；加入步骤③处理后的牛奶样品溶液10mL，涡旋萃取lmin，甲醇解吸3min，解吸液经氮气吹干，用pH7.0、100 μ L磷酸缓冲液稀释，进行毛细管电泳分析。本发明的有益效果:本发明采用SiO2与不同极性的吸附剂混合组成，这些吸附剂对疏水性能不同的化合物具有不同的选择性，从而能够有效的进行分离。本方法快速、简便，首次应用磁固相萃取技术结合毛细管电泳测定牛奶中PQQ的含量。本方法采用的毛细管电泳法加入了修饰剂环糊精，首次在毛细管电泳缓冲体系中加入三氟乙酸，解决了毛细管电泳图中峰的拖尾问题。峰的对称性明显好于文献报道。与文献方法对比，分离效率提高了 6倍。

　　0.1 % 二氣乙酸,分尚电压25kV。图4PQQ标准曲线a:牛奶磁固相萃取后的毛细管电泳图，b:含20μ g/mL PQQ标准品的牛奶溶液经磁固相萃取后的毛细管电泳图。

　　具体实施例方式实施例1( I)毛细管电泳分析条件:未涂层石英毛细管柱(41.5cmX50 μ m，河北永年县锐沣色谱器件有限公司)，新毛细管先用甲醇冲洗lOmin，蒸馏水冲洗5min，lmol/L NaOH溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min,最后再用运行缓冲液冲洗10_15min。运行缓冲液及样品溶液均用0.22 μ m微孔针头过滤器过滤。每次进样前，用蒸馏水和运行缓冲液冲洗2min。检测波长是249nm，进样方式为压力进样(0.5 ^，10.0秒)，分离电压为251^，毛细管柱温25°C。运行缓冲液为:10mmol/L硼砂-lOmmol/L β -环糊精混合液，ρΗ=8.8，含有质量浓度0.1%的三氟乙酸。( 2)缓冲体系的选择缓冲体系及浓度直接影响离子的迁移和分离。实验考察了 PQQ在甘氨酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼砂缓冲体系中的分离情况。结果峰型很差，都达不到理想的分离状况。可能PQQ分子中具有多羧基的缘故，具有较低的淌度，其淌度方向和电渗流方向相反，影响它的流出，不能得到较好的峰型。因此，本实验考虑在背景电解液中加入环糊精，β-环糊精上的14个仲羟基位于空腔的宽口，其疏水性空腔可以选择性地和分析物形成包合物。PQQ上的羧基与β_环糊精上的羟基能够形成稳定的包合物，从而影响样品的权均淌度，因此改善了分离。我们在不同缓冲体系(甘氨酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼砂缓冲液)中加入β环糊精，结果显示，硼砂环糊精缓冲体系较好，与单纯的硼砂相比，峰型有了很大的改善，能得到较尖锐的峰。( 3 )硼砂浓度的选择缓冲液浓度是一个重要的指标，对选择性的影响非常突出。我们分别用硼砂浓度5,10,15, 20mmol/L实验，当浓度大于10mmol/L时,峰形严重不对称,分离效果不佳。可能随着浓度的增加，导电的离子数增加，毛细管的电流值增大，焦耳热增加；而且随着缓冲液浓度的增加，离子强度增加，电渗流速降低，溶质在毛细管内的迁移速度下降，迁移时间会延长。当浓度小于10mmol/L时,前沿拖尾较为严重。因此,我们选择硼砂浓度为10mmol/L时最为合适。(4) pH值对迁移时间的影响缓冲液的pH值影响可解离分析物的有效电荷，决定其在电场中的迁移速度。同时它还影响Zeta电势，通过pH值的选择可有利调整电迁移和电渗的平衡，增加分离度。分别调pH3.0、5.0、7.0、8.0、9.0实验，发现pH7.0以下，峰很宽，pH大于8.0峰较好。分别测定样品在pH值为8.5,8.8,9.0,9.5、10.0的硼砂-β环糊精缓冲溶液中迁移时间，发现pH值对保留时间有明显的变化，以PH值为横坐标，保留时间为纵坐标，作图1。如图1看出，pH值对其保留时间有一定的影响，当pH大于9.0时，迁移时间增加，且峰形严重不对称，故选择pH小于9.0较为合适，综合考虑，最终选择pH为8.8。(5) β-环糊精浓度的影响环糊精的浓度直接影响它对分析物的包合， 因此，其浓度的选择非常重要。我们改变β-环糊精的浓度，分别取5，10，12，15，20mmol/L实验。当β-环糊精浓度高于20mmol/L时，分离效果欠佳，峰型不理想；当β -环糊精浓度为lOmmol/L时，峰形对称性有很大的改善，但峰的前沿和拖尾现象始终存在，有待继续优化，如图2。(6)有机溶剂的影响为了进一步优化分离，我们考虑添加有机溶剂来改善分离。加入有机溶剂往往可以使包合常数K增大，在低浓度的β_环糊精下达到分离。我们分别采用乙腈、乙醇等多种有机溶剂实验，考察其对样品PQQ分离效果的影响。结果表明，各种有机溶剂的加入，对峰的拖尾并无多大的改善。(7)三氟乙酸的影响PQQ的结构式为弱酸 性，我们考虑是否可以添加三氟乙酸来改善峰的拖尾现象。我们在硼砂-β环糊精体系中，加入少量的三氟乙酸，并考察三氟乙酸浓度的影响，在缓冲体系中分别加入0.01%, 0.05%, 0.1%的三氟乙酸实验。实验结果证明，加入少量的三氟乙酸可以很好的改善峰形的拖尾现象，按浓度来看，选择0.1%最为合适,能最有效的使峰形变得对称，如图3。(8)电压的选择溶质的出峰时间对电场强度非常敏感，电场强度会影响溶质在毛细管中的停留时间。被分析物与环糊精形成包合物后，若各组分平均迁移率相差较大，增加电场强度能提高分离度；反之，若平均迁移率相差较小，增加电场强度并不能有效改善分离。包合是一个快速可逆平衡过程，从动力学角度讲，高温不利于包合，在高电场强度下，由于焦耳热的产生，径向温度梯度增加，使包合常数K减小，分离度降低，因此，一味增加电场强度并不是一个良策，通常需要有一个平衡。在缓冲液为lOmmol/L硼砂-10mmol/Li3-环糊精混合液，pH=8.8，含有0.1%的三氟乙酸时，考查样品PQQ在10、15、20、22、25、27kV电压下的分离情况，当电压大于25kV时，分离时间缩短，分离度降低，且基线kv时，分离时间较长，实验中选择25kV最为理想。(9)线性关系与检测限测定精密称取PQQl.0mg，加ImL磷酸缓冲液(pH7.0)，用运行缓冲液稀释成浓度为0.025,0.05,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8、1.0μ g/mL的标准溶液，每个样品分别重复进样3次，

　　0.02%CTAB (w/v)，12.5% 甲醇(v/v)和 0.3mL25%(w/v)NH3 作催化剂，120°C搅拌回流 16h。用水、丙酮和正己烷依次清洗多次，60°C线mL甲醇，润旋振荡2min,离心4000rpml0min,上清液用50mLMcIlvaine buffer缓冲液(0.1M柠檬酸调0.2M磷酸氢二钠pH7.0)稀释，以备磁性固相萃取。4)磁性固相萃取称取上述制备好的50mg磁性功能纳米材料于安普瓶中，分别用ImL的甲醇和水活化；加入上述牛奶处理后的溶液IOmL,涡旋萃取lmin,甲醇解吸3min。解吸液经氮气吹干，用100 μ L磷酸缓冲液(ρΗ7.0)稀释，进行毛细管电泳分析。如图5。5)提取回收率与精密度测定称取一定量的PQQ标准品适量，使其在牛奶中的浓度为20、60、100μ g/L，按上述方法进行处理、萃取，经毛细管电泳分析测定PQQ的浓度，测定值除以理论值得PQQ提取回收率。结果见表I。表I提取回收率测定

　　权利要求1.一种磁性固相萃取-毛细管区带电泳测定生物样本中吡咯并喹呤醌含量的方法，其特征在于: (1)毛细管选择及预处理: 选用未涂层的41.5cmX 50 μ m石英毛细管柱；新毛细管柱先依次用甲醇冲洗lOmin，蒸馏水冲洗5min，lmol/L NaOH溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗10-15min ;每次进样前,用蒸懼水及运行缓冲液冲洗2min ； 运行缓冲液及样品溶液均用0.22 μ m微孔针头过滤器过滤； (2)毛细管电泳分析条件: 检测波长为249nm,进样方式为0.5psi压力进样,进样时间10.0秒,分离电压为25kV,毛细管柱温25 °C ； 运行缓冲液为:pH=8.8、10mmol/L硼砂-10mmol/L@ -环糊精-质量浓度0.1%三氟乙酸的混合液； (3)生物样本中吡咯并喹呤醌PQQ的检测 选用牛奶作为生物样本的典型 ①Fe3O4磁性纳米粒子的制备 IOOmLl.25mM FeSO4.7H2060°C下搅拌，用6M NaOH调pH至10，Ih后磁性沉淀物分离，用去离子水冲洗，60°C线磁性纳米粒子； ②改性的混合磁性功能纳米粒子Fe3O4-SiO2-Pheny1-C8的制备 将制备得到的Fe3O4磁性纳米粒子加入到含ImM四甲氧基硅烷、ImM苯基三甲氧基硅烷和ImM辛基三甲氧基硅烷混合液中，四甲氧基硅烷:苯基三甲氧基硅烷:辛基三甲氧基硅烷体积比1: 1: 1，加50mL含w/v0.01%吐温-100、w/v0.02%十六烷基三甲基溴化铵的v/vl2.5%甲醇和0.3mL w/v25%NH3作催化剂，120°C搅拌回流12 16h，用水、丙酮、正己烷依次清洗多次，60°C线h，得磁性功能纳米粒子Fe304-Si02-Phenyl-C8 ； ③牛奶样品去除蛋白 1mT,牛奶加5mL甲醇，润旋振荡2min,4000rpm离心IOmin,上清液用50mL McIlvainebuffer缓冲液稀释，以备磁性固相萃取； McIlvaine buffer缓冲液为:pH7.0,0.1M柠檬酸调0.2M磷酸氢二钠溶液； ④磁性固相萃取 称取上述制备好的50mg磁性功能纳米粒子Fe3O4-SiO2-Pheny1-C8于安普瓶中，分别用ImL的甲醇及水活化；加入步骤③处理后的牛奶样品溶液10mL，涡旋萃取lmin，甲醇解吸3min，解吸液经氮气吹干，用pH7.0、100 μ L磷酸缓冲液稀释，进行毛细管电泳分析。

　　全文摘要磁性固相萃取-毛细管区带电泳测定生物样本中吡咯并喹呤醌含量的方法，属于生命分析技术领域。本发明采用SiO2与不同极性的吸附剂混合组成，这些吸附剂对疏水性能不同的化合物具有不同的选择性，从而能够有效的进行分离。本方法采用的毛细管电泳法加入了修饰剂β-环糊精，首次在毛细管电泳缓冲体系中加入三氟乙酸，解决了毛细管电泳图中峰的拖尾问题，峰的对称性明显好于文献报道。本方法快速、简便，首次应用磁固相萃取技术结合毛细管电泳测定牛奶中PQQ的含量。与文献方法对比，分离效率提高了6倍。

　　发明者周杏琴, 毛师师, 张建康, 曹国宪, 钦晓峰 申请人:江苏省原子医学研究所

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