主 要 内 容 第一节 概述 第二节 溶剂萃取 第三节 反胶束萃取 第四节 双水相萃取 第五节 超临界流体萃取法 第六节 液膜分离法 第一节 概述 萃取 extraction:利用溶质在互不相溶的两相之间分配系数的不同而使溶质得到纯化或浓缩的方法称为萃取。 萃取剂(extractant)、轻相(light phase)、萃取相(solvent phase)、萃余相、重相(heavy phase)。 分配系数：在一定温度、压力下，溶质分布在两个不相容的溶剂里，达到平衡后，它在两相中的浓度比为一常数，这个常数称为分配系数。 按参与溶质分配的两相不同而分为 液-液萃取(liquid-liquid extraction) 液-固萃取(liquid-solid extraction) 固相萃取(solid phase extraction, SPE) 双水相萃取(two water phase extraction) 超临界流体萃取(supercritical fluid extraction) 1.3 萃取的优点 1. 萃取过程具有选择性 2. 能与其他纯化方法相配合 3. 通过相转移，减少目标产物的降解 4. 规模放大极为容易 5. 传质快、生产周期短 6. 便于连续操作、易于计算机控制 7. 无相变、能耗低、成本低 8. 方法成熟、易于设计 1.4 萃取的一般操作过程 反萃取(Back extraction)： 当萃取操作后，为进一步纯化目标产物或便于下步分离操作，往往需要将目标产物转移到水相。这种调节水相条件，将目标产物从有机相转入水相的萃取操作称为反萃取。 洗涤操作(washing processing)：对于一个完整的萃取过程，常在萃取和反萃取之间增加洗涤操作 萃取 – 洗涤 – 反萃取 1.5 分配定律与分配平衡 分配定律(distribution law) 在恒温恒压下，溶质在互不相溶的两相中达到分配平衡时，溶质在两相中的平衡浓度之比为常数 适应条件：相同分子形态（相对分子质量相同）存在于两相中的溶质浓度之比。不适合于化学萃取，因溶质在各相中并非以同一种分子形态存在。 线性平衡： 适应条件：低浓度 Langmuir型平衡 适应条件：高低浓度 a, b和n为常数 1.6 弱电解质的分配平衡 A、弱电解质的萃取理论 弱碱和弱酸的解离平衡关系分别为： Ka Kb AH ? A- + H+ BH+ ? B + H+ 弱酸性电解质的分配系数 弱碱性电解质的分配系数 B、弱电解物质萃取的影响因素 1) pH的大小； 2) Aa, Ab --- 脂溶性大小; 3) 温度是影响溶质分配系数和萃取速度的重要因素。选择适当的操作温度，有利于目标产物的回收和纯化。但由于生物产物在较高温度下不稳定, 故萃取操作一般在常温或较低温度下进行。 4) 其他因素：无机盐的存在可降低溶质在水溶液中的溶解度，有利于萃取。维生素B12 ---- 硫酸铵；青霉素 --- 氯化钠等。 3）红霉素萃取 红霉素是碱性电解质，在乙酸戊酯和pH9.8的水相之间分配系数为44.7，而水相pH降至5.5时, 分配系数降至14.4。 4）红霉素反萃取 反萃取操作同样可通过调节pH值实现。如，红霉素在pH9.4的水相中用醋酸戊酯萃取，而反萃取则用pH5.0的水溶液。 第二节 溶剂萃取 分配定律 平衡时溶质在两相中的浓度之比为一常数K，即： K ＝ 萃取相浓度/萃余相浓度＝ c1/c2 (2-1) 常温下K为常数，c的单位通常用mol/L或U/ml。 式(2-1)应用条件：(1)稀溶液；(2)溶质对溶剂之互溶度没有影响；(3)必须是同一种分子类型，即不发生缔合或离解。 弱酸或弱碱性溶质还要考虑弱电解质在水相中的电离平衡。如penicillin是一类弱酸，在水中会有一部分离解成负离子(P·COO－)，在萃取相乙酸丁酯等有机相中则仅以游离酸分子(P·COOH)的形态存在。 两相中的游离酸分子的分配平衡用分配系数K0表征 电离平衡用电离常数KP来表征。 K0和KP是客观存在的，但一般测定得到的是[P·COOH＋P·COO－]的总浓度c2，在这种情况下， c1／c2＝K 这里的K称之为表观分配系数。而K和K0、KP的关系式可经理论推导如下： K＝K0[H＋]／(Kp＋[H＋]) (弱酸) (2-2) K＝K0Kp／(Kp＋ [H＋]) (弱碱) (2-3) 由此可见，溶质在不互溶两相中的分配不仅与本身的性质(决定KP)、萃取溶剂(决定K0)有关，也与水相的pH有关。 分离因数 若原来的料液中除溶质A以外，还含有溶质B，则由于A、B的分配系数不同， A和B就得到了一定程度的分离。如A的分配系数较B大，这样萃取剂对溶质A和B分离能力的大小可用分离因数β来表征： β＝(c1A/c1B)/(c2A/c2B)＝(c1A/c2A)/(c1B/c2B) ＝KA/KB (2-4) 下标1、2分别代表萃取相和萃余相，A、B为溶质 如果A是产物，B为杂质，分离因数可写为： β ＝ K产／K杂 β越大，A、B的分离效果越好，即产物与杂质越容易分离。 2.1萃取剂或稀释剂的选择 选择原则：根据相似相溶的原理(最重要参数：介电常数，极性)，选择与目标产物性质相近的萃取剂，可以得到较大分配系数。此外，有机溶剂还应满足以下要求： 1)、价廉易得； 2)、与水相不互溶； 3)、与水相有较大的密度差，并且粘度小，表面张力适中，相分散和相分离较容易； 4)、容易回收和再利用； 5)、毒性低，腐蚀性小，闪点低，使用安全； 6)、不与目标产物发生反应。 常用于抗生素类萃取剂有：丁醇等醇类、乙酸乙酯、乙酸丁酯和乙酸戊酯等乙酸酯类以及甲异丁基甲酮等。 化学萃取aa的稀释剂主要有: 煤油、乙烷、异辛烷、正十二烷等。 2.2 水相条件的影响 由于产物所在的水相中往往还存在与产物性质相近的杂质、未完全利用的底物、无机盐、其他营养成分等。必须考虑这些物质对萃取过程的影响。 (1) pH值 分配系数 K 分离因素β [AH] K K表= ———— = ———— [AH]+[A-] 1+10(pH-pKP) 稳定性 (2) 温度 温度会影响生化物质的稳定性。 影响分配系数K。 T↑，K↑，互溶性↑，效率↓ T↓，K↓，稳定性↑，传质速率↓ (3) 盐析 盐析效果 去乳化 增大水相密度 (4) 带溶剂 为提高分配系数K，常添加带溶剂。带溶剂是指能和产物形成复合物，促使产物更易溶于有机溶剂相中，在一定条件下又要容易分解的物质。 酸性物质+脂肪碱（十二烷胺、四丁胺等） 碱性物质+脂肪酸（月桂酸等） 2.3 乳化现象和去乳化 2.3.1 乳化现象 2.3.3 乳状液稳定条件=乳化剂=表面活性剂 降低界面张力，降低表面自由能 界面电荷 界面膜 增大介质黏度 2.3.5去乳化方法 加热 稀释 离心 过滤 静电 电解质 顶替法 转型法 2.4 萃取方式和理论收得率 工业上萃取操作通常包括三个步骤： 混合—分离—溶剂回收 因而工业萃取的流程中须有混合器(如搅拌混合器)、分离器(如碟片式离心机)和溶剂回收装置(如蒸馏塔)。混合萃取和分离也可在同一台设备内完成。 一般萃取过程很快，如果接触表面足够大，则在15~60 s之内就可完成。 萃取操作流程可分为单级萃取和多级萃取。 2.4.1 单级萃取 萃取操作理论收得率的计算须符合以下两个假定： ① 萃取相和萃余相很快达到平衡 ② 两相完全不互溶，在分离器中能完全分离。 设K为分配系数，VF为料液体积，VS为萃取剂体积，E为萃取因子(extraction factor)即萃取平衡后，溶质在萃取相与萃余相中质量的比值，则： E＝K·VS/VF＝K/m (2-5) 式中 m＝VF/VS＝料液体积/萃取剂体积 令未被萃取的体积分数为φ，则： φ＝1/(E＋1) (2-6) 而理论收得率为： 1－φ＝E/(E＋1) (2-7) 例1：利用乙酸乙酯萃取发酵液中的放线菌素D(Actinomycin D), pH3.5时分配系数m =57。令H = 450 l/h,单级萃取剂流量为39 l/h。计算单级萃取的萃取率。 解: 单级萃取的萃取因子：E = 57*39/450 = 4.94 单级萃取率： = 4.94/（1+4.94） = 0.832 2.4.2 多级错流接触萃取 多级错流接触过程 假设每一级溶质分配均达到线性平衡, 即 且每一级萃取剂流量相等(= L), 则第i级物料衡算式为 其中， 萃余率: 萃取率： . 多级错流接触萃取 如每一级溶质分配为非线性平衡, 或每一级萃取剂流量不等, 则各级的萃取因子Ei也不相同,可采用逐级计算法，为 例3：利用乙酸乙酯萃取发酵液中的放线菌素D(Actinomycin D), pH3.5时分配系数m =57。采用三级错流萃取, 令H = 450 l/h, 三级萃取剂流量之和为39 l/h。分别计算L1 = L2 = L3 = 13 l/h和L1 = 20, L2=10, L3 = 9 l/h时的萃取率。 解3: 萃取剂流量相等时，E = 1.65 用右侧方程得：1-?3 = 0.946。 若各级萃取剂流量不等, 则E1 = 2.53，E2 = 1.27，E3 = 1.14，由右式得 1-?’3 = 0.942. 所以，1-?3 1-?’3 单级萃取的萃取率 = 0.832 例4：赤霉素二级错流萃取时，第一级用1/2体积乙酸乙酯，第二级用1/10体积乙酸乙酯，问理论收得率为多少？ 解4： E1＝35／2＝17.5 E2＝35／10＝3.5 理论收得率 1－φ ＝1－1／[(17.5＋1)×(35＋1)]＝98.79％ 2.4.3 多级逆流接触萃取 将多个混合-澄清器单元串联起来,分别在左右两端的混合器中连续通入料液和萃取液,使料液和萃取液逆流接触,即构成多级逆流接触萃取. 多级逆流接触萃取 第i级的物料衡算式为 (i = 1, 2, 3, …, n) 多级错流萃取由于溶剂分别加入各级萃取器，故萃取推动力较大，萃取效果较好。缺点是需加入大量的溶剂，因而产品浓度稀，需消耗较多的能量回收溶剂。 例5：赤霉素进行二级逆流萃取，乙酸乙酯用量为1/2体积，问理论收得率为多少？ 解5： E＝35／2＝17.5 n＝2 理论收得率 1－φ ＝[17.53－17.5]／[17.53－1] ＝99.7％ 由上可见三种萃取过程中，以逆流萃取收率最高，溶剂用量最少。因而也是工业上普遍采用的流程。 例6：设例3中操作条件不变(L = 39 l/h), 计算采用多级逆流接触萃取时使收率达到99% 所需的级数。 解6：E = mL/H = 4.94; 因为收率为99%, 即 1 - ?n = 0.99, 则上式得n = 2.74, 故需要三级萃取操作。 可计算采用三级逆流接解萃取的收率为99.3%, 高于例2的错流萃取, 说明多级逆流接触萃取效率优于多级错流萃取. 2.5 分馏萃取 第三节 反胶团萃取 反胶团（reversed micelles）是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。是一种自我组织和排列而成的，并具热力学稳定的有序构造。 反胶团的微小界面和微小水相具有两个特异性功能： ①具有分子识别并允许选择性透过的半透膜的功能； ②在疏水性环境中具有使亲水性大分子如蛋白质等保持活性的功能。 因此，反胶团可作为： 生物膜的简化模型； 作为显示酶类性质的一种模型进行基础性研究； 作为具有新型功能的疏水性反应场； 作为酶和微生物的一种新型的固定化方法； 作为微小型的生物反应器； 在生物技术领域中作为生理活性物质以及生物活性大分子的特异性分离场（分离、浓缩等方法）。 3.1 反胶团萃取技术的特点 ①有很高的萃取率和反萃取率并具有选择性； ②分离、浓缩可同时进行，过程简便； ③能解决蛋白质（如胞内酶）在非细胞环境中迅速失活的问题； ④表面活性剂往往具有细胞破壁功效，可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶； ⑤成本低，溶剂可反复使用等。 3.2 反胶团的形成 当向水溶剂中加入表面活性剂时，如表面活性剂的浓度超过一定的数值时，形成正胶团（normal micelle）。 当向非极性溶剂中加入一定量的表面活性剂时，会形成反胶团或反向胶团（reversed micelles）。 在反胶团中有一个极性核心，它包括由表面活性剂极性端组成的内表面、平衡离子和水，被称之为“水池”（water pool）。这个“水池”具有极性，可以溶解具有极性的分子和亲水性的生物大分子。 常用的表面活性剂 AOT（Aerosol OT），其化学名称是琥珀酸二（2-乙基己基）酯磺酸钠，结构式下 CTAB（溴代十六烷基三甲铵）、TOMAC（氯化三辛基甲铵）、PTEA（磷脂酰乙醇胺）。 常用的非极性有机溶剂 有环己烷、庚烷、辛烷、异辛烷、己醇、硅油等。 反胶团的物理化学特性 临界胶束浓度（CMC） ：胶束形成时所需表面活性剂的最低浓度。 0.1～1.0 mmol/L的范围内。 反胶团含水率W W用水和表面活性剂的浓度之比来定义，即 W＝c水／c表 W是个非常重要的参数，W越大，反胶团的半径越大。 反胶团“水池”中的水与普通水差异大。当W＜6～8时，微水相中的水分子被表面活性剂亲水性基团强烈地束缚，其表观粘度可增大到普通水粘度的50倍，且疏水性非常强。另外，其冰点通常低于0℃。 在AOT反胶团中，水合化一分子AOT需要6～8个水分子，而其他水分子则不受束缚，可与普通水一样自由流动，所以当W＞16时，“水池”中的水逐渐接近主体水相粘度，胶团内也形成双电层。 反胶团的制备 1.液液接触法 即将含蛋白质的水相与含表面活性剂的有机相接触。 2.注入法 将含有蛋白质的水溶液直接注入到含有表面活性剂的非极性有机溶剂中去。这种方法的过程较快并可控制反胶团的平均直径和含水量。 3.溶解法 对非水溶性蛋白质可用该法。将含有反胶团（W＝3～30）的有机溶液与蛋白质固体粉末一起搅拌，使蛋白质进入反胶团中，该法所需时间较长。含蛋白质的反胶团也是稳定的。 3.3 反胶团萃取蛋白质的基本原理 反胶团萃取是有机相-水相间的分配萃取。 是从主体水相向溶解于有机溶剂相中反胶团微水相中的分配萃取。 同时也是一个 浓缩操作。 改变水相条件 可实现反萃取。 蛋白质溶解模型 蛋白质向非极性溶剂中反胶团的纳米级水池中的溶解，有下图所示的四种可能。 蛋白质溶入反胶束的推动力 A 静电作用： 理论上,当溶质所带电荷与表面活性剂相反时,由于静电引力的作用,溶质易溶于反胶团,溶解率或分配系数较大,反之,则不能溶解到反胶团相中。右图为pH值对不同蛋白质的溶解率急剧变化。 B 空间相互作用 盐浓度增大对反胶团相产生脱水效应, 含水率W0随盐浓度的增大而降低,反胶团直径减小, 空间排阻作用增大, pro溶解下降. 如，AOT/异辛烷系统的含水率与I-0.5成正比。图中W0与NaCl浓度关系为: 在各pro的pI处(排除了静电相互作用的影响)，反胶团萃取实验研究表明: 随着M增大, pro的分配系数(m, 溶解率)下降。当M 20KD时, m很小。表明随M增大, 空间排阻作用增大, pro的溶解率降低。图的结果还表明, 要据pro间M的差别可以选择性对pro进行萃取分离。 C 疏水性相互作用 Aa的疏水性各不相同, 研究表明,除pH和I外, Aa或肽的m随Aa疏水性的增大而增大。蛋白质的疏水性影响其在反胶团中的溶解形式,因而影响其分配系数。疏水性较大的pro可能以“半岛式”形式溶解。 D 分配系数m(or K): 4 反胶束萃取的操作 A 萃取的基本方法 B 反萃取 . 3.4 反胶束萃取的影响因素 2)、盐浓度 3)、盐离子的种类 4)、蛋白质分子量M 5)、表面活性剂 A 种类 B 浓度 6)、助表面活性剂 3.5 反胶束萃取的应用 1)、蛋白质分离 2)、胞内酶的提出 3.6 反胶团萃取过程 3.6.1多步间歇混合／澄清萃取过程 图2-21是在pH 9时，核糖核酸酶的溶解率很小，保留在水相而与其他两种蛋白质分离；相分离得到的反胶团相（含细胞色素C和溶菌酶）与0.5 mol/L的KCl水溶液接触后，细胞色素C被反萃到水相，而溶菌酶的保留在反胶团相。此后，含有溶菌酶的反胶团相与2.0 mol/L KCl，pH 11.5的水相接触，将溶菌酶反萃回收到水相中。 图2-21 反胶团萃取分离蛋白质的工艺过程 3.6.2 连续循环萃取-反萃取过程 图2-22为连续循环萃取-反萃取过程，该过程由两个混合／澄清单元构成，左侧单元用于反胶团萃取，经沉降澄清器后反胶团相进入右侧单元的混合器进行反萃取。 第四节 双水相萃取 定义： 利用生物物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行分离的过程。 如下图中，2.2％的葡聚糖水溶液与等体积的0.72％甲基纤维素钠的水溶液相混合并静置后，可得到两个粘稠的液层。 上述现象称为聚合物的不相溶性(incompatibility)。 如果多种不相溶的聚合物混在一起，就可得到多相体系。 聚合物的不相溶性主要是由于聚合物分子的空间阻碍作用，相互间无法渗透，当聚合物的浓度达到一定值时，就不能形成单一的水相，所以具有强烈的相分离倾向。 某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液相混合时，只要浓度达到一定值，也会形成两相，即聚合物-盐双水相体系，成相机理尚不清楚，一种解释为“盐析”作用。 某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统。利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质，Albertsson于50年代后期开发了双水相萃取法，又称双水相分配法。 70年代以后，Kula，Hustedt和Johansson等发展了双水相萃取技术在生物分离过程中的应用，为蛋白质特别是胞内蛋白质的分离与纯化开辟了新的途径。 现在的研究已涉及到酶、核酸、生长激素、病毒等各种物质的分离和提纯。 4.1 双水相分离理论 双水相体系 两种都是非离子型高聚物（PEG/DEX、聚丙二醇/DEX等） 其中一种是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX） 两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/羧甲基葡聚糖钠） 其中一种是无机盐（PEG/磷酸钾、硫酸钠等） 相图 双水相的形成条件和定量关系常用相图表示，图2-7是PEG/Dex体系的相图。TCB称为双节线(binodal)，双节线以上的区域为 两相区。上相组成用 T(Top)表示，下相组 成用B(Bottom)表示。 连接T、B两点的线段 TB称为系线(tie line)， 系线上各点处系统的 总浓度不同，但均分 成组成相同而体积不 同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则。 如点M为整个系统的组成，该系统实际上由T、B所代表的两相组成，vT表示上相体积，vB表示下相体积，则： vT／vB＝BM／MT (2-10) 系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大。当点M向下移动时，系线长度缩短，两相差别减小，到达C点时，系线，两相间差别消失而成为一相，因此C点为系统临界点(critical point)。 双节线的位置和形状与聚合物的相对分子质量有关。聚合物Dex的相对分子质量越高，相分离所需的浓度越低；两种聚合物相对分子质量相差越大，双节线。 PEG的相对分子质量固 定(PEG6000)而Dex的相 对分子质量如下： 1.D5 (Mn2800， Mr3400) 2.D17(Mn23000，Mr30000) 3.D24(Mn23000) 4.D37(Mn88000，Mr179000) 5.D43(Mn180000，Mr460000) 6.D170(Mn630000，Mr2200000) Mn—数均分子量 Mr—重均分子量 物质在两相中的分配 和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分配系数K表示。 K ＝ cT／cB 式中 cT、cB分别代表上相、下相中溶质的浓度。 K与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关，与溶质的浓度无关。 影响分配系数的主要因素，可用Gerson公式表示： －lgK＝A Δγ＋δΔφ＋β (2-11) 式中 A—表面积；Δγ—两相表面自由能之差；δ—电荷数；Δφ—电位差；β—标准化学位和活度系数等组成的常数 表面自由能可用来量度表面的相对憎水性，改变成相聚合物的种类。聚合物的平均分子量和相对分子质量分布，都能影响相的疏水性。 一般地，大分子的表面积A都很大，Δγ的微小变化都会引起蛋白质大分子的分配系数产生很大变化；加入系统的盐，以及体系的pH会影响相间电位差Δφ和蛋白质所带的电荷数δ，因而也对分配系数产生大的影响。 由于影响分配系数的因素很多，加上各因素间又互相影响，因此定量地将蛋白质的一些分子性质与分配系数关联起来是困难的，最佳的双水相操作条件还得依靠实验来获得。 4.2 影响分配平衡的参数 聚合物及成相盐的种类及浓度 聚合物的平均分子量 体系的pH值及其他盐的种类及浓度 菌体或细胞的种类及含量、体系温度等。 聚合物及其分子量的影响 不同聚合物，水相系统显示不同的疏水性，水溶液中聚合物的疏水性依下列次序递增：葡萄糖硫酸盐＜甲基葡萄糖＜葡萄糖＜羟丙基葡聚糖＜甲基纤维素＜聚乙烯醇＜聚乙二醇＜聚丙三醇，这种疏水性的差别对目的产物与相的相互作用是重要的。 同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加，其大小的选择依赖于萃取过程的目的方向，若想在上相获得较高的蛋白质收率，对于 PEG/盐系统，应降低PEG聚合物的平均分子量，相反，若想在下相获得较高的蛋白质收率则平均分子量应增加。 双水相萃取糖化酶的结果(见表2-1) 表明，PEG平均分子量增大，分配系数减少。当分子量为400时，K＞1，酶主要分布于上相，当分子量大于400时，K＜1，酶主要分布于下相。主要原因是随着PEG分子量的增大，其端基数目减小，因而疏水性增加，使糖化酶在上相的表面张力增大，而使λ＜0，从而转入下相，为了使酶分布于上相，应选用分子量为400的PEG。 表2-1 PEG平均分子量对分配平衡的影响 系统 K 相体积 产率％ PEG400 (31.36％)—(NH4)2SO4 (14.05％) 6.28 4.75 96.8 PEG1000 (21.77％)—(NH4)2SO4 (12.76％) 0.26 3.0 43.5 PEG4000 (12.67％)—(NH4)2SO4 (12.14％) 0.30 4.1 59.8 PEG6000 (15.76％)—(NH4)2SO4 (12.34％) 0.03 1.2 2.1 在PEG/Dex双水相系统中，PEG分子量的减少，会使蛋白质的K值明显增大，如图2-9。 Dex水解程度的不同，对K值也有一定的影响。 系线长度对分配平衡的影响 相图中系线长度由组成的总浓度决定，在临界点附近，系线长度趋向于零，上相和下相的组成相同，因此，分配系数应该是1，随着聚合物和成相盐浓度增大，系线长度增加，上相和下相相对组成的差别就增大，产物如酶在两相中的表面张力差别也增大，这将会极大地影响分配系数，使酶富集于上相。 仍以PEG—(NH4)2SO4系统双水相萃取糖化酶为例，增加PEG400的浓度有利于酶在上相的分配，当PEG400浓度在25％～27％时，分配系数高达47.3，浓度过高则不利于酶的分配；在PEG400浓度固定为26％时，增加(NH4)2SO4的浓度，糖化酶的分配系数也增大，这主要是由于(NH4)2SO4盐析作用影响增强的缘故，最适浓度为16％，过高也不好，酶蛋白会因盐析作用过强而产生沉淀。 体系中无机盐离子的影响 在PEG/Dex中，无机盐离子在两相中也有不同的分配(见表2-2)，因此在两相间形成电位差。由于各相要保持电中性，这对带电生物大分子，如蛋白质和核酸等的分配，产生很大的影响。 表2-2 一些无机离子的分配系数 正离子 分配系数K＋ 负离子 分配系数K－ K＋ 0.824 I－ 1.42 Na＋ 0.889 Br－ 1.21 NH4＋ 0.92 Cl－ 1.12 Li＋ 0.996 F－ 0.912 在体系中加入适当的盐类，会大大促进带相反电荷的两种蛋白质的分离。 当pH 6.9时，溶菌酶带正 电，卵蛋白带负电。 在PEG/Dex体系中加入 NaCl，产生电位差，上 相电位小于下相电位， 导致带正电荷的溶菌酶 大量迁移到上相，其K 值增大，而带负电荷的 卵蛋白迁移到下相，从 而使溶菌酶和卵蛋白得 以较好地分离。 体系pH的影响 pH会影响蛋白质中可离解基团的离解度，因而改变蛋白质所带电荷和分配系数；另外，pH还影响系统缓冲物质磷酸盐的离解程度，从而影响分配系数。 pH微小的变化有时会使蛋白质的K改变2～3个数量级。 对一种特定的蛋白质，在不同盐系统中，pH和其分配系数之间的关系应不同，而在等电点时，得到的均为不带电时分子的分配系数。对不同的盐系统，其等电点时的分配系数应相等，两条pH和分配系数关系的曲线必交于一点，该点所对应的pH值即为该特定蛋白质的等电点。根据这一原则测定蛋白质等电点的方法，称为交错分配法(Cross partitioning)，如图2-11所示。 图2-11 血清蛋白在两种盐系统中 分配系数 K 与 pH 的关系(交错分配) 体系温度的影响 温度影响相图，同时影响分配率和蛋白质的生物活性。一般地，临界点附近，温度对分配率的影响较大，远离临界点时，影响较小。 在考虑温度对分配率的影响时，必须考虑到过程的能量消耗和分离过程中蛋白质的停留时间。由于亲水聚合物的多元醇或多糖结构保护了蛋白质，蛋白质在双水相中的稳定性增加，所以一般都可在室温下操作。从省掉冷却系统的室温操作过程中各相前后温度的变化可知，分离后上、下相的温度上升不多，说明无冷却系统的室温操作是可行的。 4.3 双水相萃取技术的应用 双水相萃取技术目前较多地应用于胞内酶的提取和精制上。 用双水相萃取技术处理细胞匀浆液，既可方便地除去细胞碎片，还可使酶得到精制。 要成功地运用双水相萃取方法，应满足下列条件 ①欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中； ②酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时一次萃取，就能得到较高的收率； ③两相用离心机很容易分离。 在双水相体系中，通常将目的蛋白质分配在上相(PEG)，而细胞碎片分配在下相(盐)。 蛋白质在多数情况下收率能达到90％；分配系数K在2～20之间，一般能大于3；很多杂蛋白也能同时除去。PEG/盐系统应用得很广泛，主要由于PEG价格低廉以及该系统选择性。 萃取操作时单位重量相系统中匀浆液的加入量一般每1 kg萃取相系统以处理200～400 g湿菌体为宜。 使用PEG/盐系统提取胞内酶时，使细胞碎片分配到下相中是比较容易的，如用18%的PEG 1550、7％磷酸钾系统处理20％湿细胞碎片时，细胞碎片能全部转入下相(盐相)。 分配在上相中的蛋白质可通过加入适量的盐(有时也补充适量的PEG)，进行第二次双水相萃取，目的是除去核酸和多糖，它们的亲水性较强，因而易分配在盐相中，蛋白质就停留在上相PEG中。 在第三次萃取中，应使蛋白质分配在盐相(如调节pH)，以便和主体PEG分离，色素因其憎水性而通常分配在上相；盐相中的蛋白质可用超滤法弃除残余的PEG，主体PEG可循环使用。 双水相萃取法另一优点为易于放大，分配系数K值重复性好，故可直接放大。 4.4 双水相萃取技术的进展 4.4.1进一步提高目的蛋白的纯度 目的物还含有少量的核酸和多糖，进一步提高目的蛋白的纯度，可从双水相体系和萃取操作方式两方面进行改进。 近年来发展起来的PEG衍生物。如在PEG上引入亲和基团或离子基团：(CH3)3N＋-PEG-N＋(CH3)3，ConA-PEG-ConA等。目的蛋白的得率和纯度都有很大的提高。 可采用多级萃取。 4.4.2廉价双水相体系的开发 生物工程中得到应用的两种双水相体系，即高聚物／高聚物和高聚物/盐体系。两种体系比较见表2-3。 表2-3 两种双水相体系的比较 体系 优点 缺点 PEG/dextran 盐浓度低，活性损失小 价格贵，粘度大，分相困难 PEG/盐 成本低、粘度小 盐浓度高，活性损失大，界面吸附多 从表可见，高聚物/高聚物体系对活性物质变性作用小，界面吸附少，但价格高。因而寻找廉价的高聚物/高聚物双水相体系是双水相萃取技术应用的一个重要发展方向。 目前比较成功的是用变性淀粉PPT（hydroxypropyl derivative of starch）代替昂贵的Dextran。 PPT/PEG体系比PEG/盐体系稳定。和PEG/dextran体系相图非常相似： ①蛋白质溶解度大。蛋白质在PPT浓度到15％以前没有沉淀，而在PEG浓度大于5％时，溶解度显著地减小。 ②粘度小。PPT的动力粘度只是粗Dextran的1/2，因而可以大大改善传质效果。 ③价格便宜。 4.4.3双水相萃取技术同其他分离技术结合 ①双水相体系同生物转化相结合 将双水相萃取同生物转化结合在一起，可解决在许多生物转化中存在的两个问题：一是由于双水相体系对菌体及酶没有毒性，同时又可将产物萃入上相，所以可消除产物抑制效应；二是使分布在下相的细胞(酶)循环使用，从而为固定化细胞及酶的应用开辟了新路。 ②双水相萃取同膜分离技术结合 可解决双水相体系容易乳化和生物大分子在两相界面的吸附等问题并能加快萃取速率。 第五节 超临界流体萃取 超临界流体萃取supercritical fluid extraction，SCFE：利用超临界流体（supercritical fluid，SCF），即其温度和压力略超过或靠近临界温度（Tc）和临界压力（pc），介于气体和液体之间的流体作为萃取剂，从固体或液体中萃取出某种高沸点或热敏性成分，以达到分离和提纯的目的。 5.1 超临界CO2的溶剂特征 超临界CO2的相图 利用不同密度下的 CO2对物质溶解能 力的差异就可以实 现萃取和分离的操 作，即通过压力或 温度的改变就可能 有效地萃取和分离 溶质。 表2-5 一些超临界萃取溶剂的临界点性质 溶剂 临界温度 临界压力 临界密度 (℃) (MPa) (kg/m3) 乙烷 32.3 4.88 203 丙烷 96.9 4.26 220 丁烷 152.0 3.80 228 乙烯 9.9 5.12 227 氨 132.4 11.28 235 二氧化碳 31.3 7.38 460 二氧化硫 157.6 7.88 525 水 374.3 22.11 326 氟里昂-13 28.8 33.9 578 CO2在工业上应用广泛。它无毒，无腐蚀性，不可燃烧，纯度高且价格低。又有优良的传质性能，扩散系数大，粘度低，而且和其他用做超临界流体的溶剂相比，CO2具有相对较低的临界压力和临界温度，适合于处理某些热敏性生物制品和天然物产品。 在超临界流体萃取技术的应用中，某些场合的目的是得到萃取物，而在另一些场合下，是为获得萃取后的余留物质，萃取物则为其次。超临界CO2（supercritical carbon dioxide，SC-CO2）萃取技术适用于上述两种情况。 将1≤Tr≤1.4，

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