思考题 1 衡量分离效果的因素主要是哪些？ 2 试述影响萃取效果的主要因素？ 3 选择萃取溶剂时还应考虑哪些方面？ 4 请详述产生乳化的原因及消除乳化的具体措施？ 5 系统分析法中萃取操作中的三部位法和四部位法常用的溶剂各是何物？ 一 液-液萃取法 1 液－液萃取原理 液-液萃取法即两相溶剂提取，是利用混合物中各组分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不间而达到分离目的的方法。简单的萃取过程是将萃取剂加入到样品溶液中，使其充分混合，因某组分在萃取剂中的平衡浓度高于其在原样品溶液中的浓度，于是这些组分从样品溶液中向萃取剂中扩散，使这些组分与样品溶液中的其他组分分离。 组分A在两相间的平衡关系可以用平衡常数K来表示：K＝CA/C(A。 式中CA: 组分A在苯取剂中的浓度； C(A:组分A在原样品溶液中的浓度。这就是分配定律。对于液一液萃取，K通常称为分配系数，可将其近似地看做组分在萃取剂和原样品溶液中的溶解度之比。 物质在萃取剂和原溶液中的溶解度差别越大，K值越大，萃取分离效果越好。当K≥100时，所用萃取剂的体积与原溶液体积大致相等时，一次简单萃取可将99%以上的该物质萃取至萃取剂中，但这种情况往往很少。K值取决于温度、溶剂和被萃取物的性质，而与组分的最初浓度、组分与溶剂的质量无关。 萃取过程的分离效果主要表现为被分离物质的萃取率和分离纯度。萃取率为萃取液中被萃取的物质与原溶液中该物质的溶质的量之比。萃取率越高，表示萃取过程的分离效果越好。 1.1 影响萃取效果的因素 影响分离效果的主要因素包括:萃取剂、被萃取的物质在萃取剂与原样品溶液两相之间的平衡关系(主要表现为被萃取物质在萃取剂与原样品溶液两相中的溶解度差别)、在萃取过程中两相之间的接触情况。被萃取物质在一定的条件下，主要决定于萃取剂的选择和萃取次数。 1.1.1萃取溶剂的选择 萃取剂对萃取效果的影响很大，萃取溶剂选择的主要依据是被萃取的物质的性质，相似相溶原理是萃取剂选择的基本规则。选择萃取溶剂时还应考虑以下几个方面。 (1)分配系数 被分离物质在萃取剂和原溶液之间的分配系数是选择萃取剂首先应考虑的问题(可以根据被分离物质在萃取剂和原溶液中的溶解度来做大致判断)。分配系数K大，表示被萃取组分在萃取相的组成高(被萃取物质在萃取剂中的溶解度大)，萃取剂用量小，溶质容易被萃取出来。 (2)密度 在液－液萃取中两相间应保持一定的密度差，以利于两相的分层。 (3)界面张力 萃取体系的界面张力较大时，细小的液滴比较容易聚集，有利于两相的分离，但界面张力过大，液体不易分散，难以使两相很好地混合;界面张力过小时，液体易分散，但易产生乳化现象使两相难以分离。因此，应从界面张力对两相混合与分层的影响综合考虑，一般不易选择界面张力过小的萃取剂。 (4)黏度 萃取剂黏度低，有利于两相的混合与分层，因而黏度低的萃取剂对萃取有利。 (5)其他萃取剂 应有良好的化学稳定性，不易分解和聚合。一般选择低沸点溶剂，以利于萃取剂容易与溶质分离和回收，且毒性应尽可能低，此外，价格、易燃易爆性、购买难度等都应加以考虑。 常用的萃取溶剂有石油醚、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、及正丁醇等。如果在水溶液中的有效成分是不溶于水的亲脂性物质，一般多用亲脂性有机溶剂，如苯、石油醚做萃取剂。 较易溶于水的甾体、黄酮等物质用氯仿、、二氯甲烷等进行萃取;偏于亲水性的物质，在亲脂性溶剂中难溶解，就用弱亲脂性的溶剂。如乙酸乙醋、丁醇、水饱和的正丁醇等。混合溶剂的萃取效果常比单一溶剂好得多。一苯、氯仿一乙酸乙酯(或四氢呋喃)都是良好的混合溶剂，也可以在氯仿、中加入适量的乙醇或甲醇制成亲水性较大的混合溶剂来萃取亲水性成分。一般有机溶剂亲水性越大，与水两相萃取时的效果就越不好，因为亲水性大的有机溶剂能使较多的亲水性杂质伴随而出，当从水相萃取有机物时，向水溶液中加入无机盐能显著提高萃取效率，这是由于加入无机盐后降低了被提取组分在水中的溶解度，从而使被提取组分在两相的分配系数发生了变化。对于酸性萃取物常向水溶液中加入硫酸铵，对于中性和碱性物质应向水溶液中加入氯化钠。 实际应用中常采用一些可以与被萃取物质反应的酸、碱作为苯取剂。例如，用10%的碳酸钠水溶液可以将有机羧酸从有机相萃取到水相，而不会使酚性物质转化为溶于水的酚钠，所以酚性物质仍留在有机相。但用5%~10%的氢氧化钠水溶液可以将羧酸和酚性物质一起萃取到水相，用5%~10%稀盐酸可以萃取有机氨类。 1.1.2萃取次数的影响 根据分配定律，当萃取剂用量一定时，萃取次数越大，溶液中被萃取物的总量则越小，萃取效果就越好。操作时可将全部萃取剂分为多次萃取比一次全部用完萃取效果好。但当萃取总量不变时，萃取次数增加，每次萃取剂的用量就要减小，当萃取次数达到或超过 5时，萃取次数与每次萃取时萃取剂的用量这两种因素的影响几乎抵消，再增加萃取次数，溶液中被萃取物的总量变化很小。所以一般同体积溶剂分3~5次萃取即可。 两相溶剂萃取在操作时的注意事项 1 萃取前先用小试管做预试验，观察萃取后二液相分层现象和萃取效果。如果容易产生乳化，大量萃取时要避免猛烈震摇，可通过延长萃取时间达到萃取效果。检查不同溶剂的萃取效果可以通过薄层色谱法。 2 样品水溶液的相对密度最好在1. 1 ~1. 2之间，过稀则溶剂用量太大影响操作，并且有效成分的回收率低，过浓则提取不完全。 3 溶剂与样品水溶液应保持一定的比例，第一次提取时溶剂要多一些，一般为样品水溶液的1/3，以后的用量可以少一点，一般为1/4~1/5。 4 萃取溶液呈碱性时，常出现乳化现象，有时由于在水溶液中有少量轻质沉淀，两相密度接近，两液相部分互溶等都会引起分层不明显或不分层。此时，可以长时间静置；或加入食盐增加水相的密度，使絮状物溶于水中，迫使有机物溶于有机相萃取剂中；或用玻璃棒不断搅拌进行机械破乳；有时由于两相溶剂的比例正好使两相溶剂完全乳化，这时应加入其中一种溶剂改变原来的溶剂比例，然后再进一步破乳。如果上述方法不能将乳化层破坏，在分液时，应将乳化层与萃余相(水层)一起放出，再进行萃取。也可将乳化层单独分出，再用新溶剂萃取；或将乳化层抽滤；或将乳化层稍稍加热；超声乳化层等等； 5 一般萃取3~4次即可。但亲水性成分不易转入有机溶剂层时，需增加萃取次数。具体萃取次数可以通过薄层色谱法来确定。 6 微量萃取时用离心试管，萃取后用滴管将萃取相吸出； 7 小量萃取时用分液漏斗，注意上层液体从上口倒出，下层液体由下口经活塞放出；中置萃取可以用适当的下口瓶，用搅拌器搅拌一定时间使两相混合后，静置分层。 1.1.3液一液萃取法的应用 液一液萃取法是天然有机化合物分离中常用的分离方法。如果已经知道要得到的目的化合物的结构时，可以直接根据相似相溶的原理和有关萃取剂选择的规律，去选择一种合适的萃取剂把目的化合物萃取出来。 当对一种植物进行系统分离分析时，往往不知道化合物的结构，而植物浸提液常是含有极性差别很大的有机化合物的混合物，如果直接用结晶、柱层析等分离方法无法分离，这时一般先用不同极性的有机溶剂萃取。把植物提取物分成不同极性范围的部分(部位分离)，然后再对每一部位进行逐步的分离分析。这种方法是系统分析法。 一般常用的萃取分离溶剂为：小极性溶剂石油醚、苯、环己烷等；中极性溶剂氯仿、、乙酸乙酯等；大极性溶剂正丁醇、水饱和正丁醇、乙醇等。常用的部位分离法有三部位法，如石油醚(小极性)、氯仿(中极性)、正丁醇(大极性)和四部位法，如苯(小极性)、氯仿(中小极性)、乙酸乙醋(中大极性)、水饱和正丁醇(大极性)。在具体研究中，可以根据情况选择分段数目和每一段所用的萃取剂。 二 沉淀分离法 思考题： 1 应用沉淀分离技术时，需要考虑的三种因素分别是什么？ 2 根据沉淀剂和沉淀条件的不同，沉淀分离可分为哪些种类？ 3 乙醇作为最常用的溶剂沉淀的沉淀剂，其可沉淀的物质种类有哪些？ 4 影响盐析效果的因素有哪些？ 5 沉淀剂沉淀常见的有哪四类？ 6 试述泡沫分离应具备的两个条件？ 沉淀分离是在溶液中加入溶剂或沉淀剂，通过化学反应或者改变溶液的pH值、温度、压力等条件，使分离物以固相物质形式沉淀析出的一种方法。能否将分离物从溶液中析出，取决于分离物的溶解度或溶度积，关键在于选择适当的沉淀剂和控制条件，沉淀的目的在于通过沉淀使目标成分达到浓缩和去杂质，或是将已纯化的产品由液态变成固态。在应用沉淀分离技术时，需要考虑三种因素：沉淀的方法和技术应具有一定的选择性，才能使目标成分得到较好分离，纯度较高；对于一些活性物质(如酶、蛋白质等)的沉淀分离，必须考虑沉淀方法对目标成分的活性和化学结构是否破坏；对于食品和医药中的目标成分的沉淀分离，必须充分估量残留物对入体的危害。 根据沉淀剂和沉淀条件的不同，沉淀分离方法大致可分为：溶剂沉淀、盐析沉淀、沉淀剂沉淀等。 溶剂沉淀 溶剂沉淀是在有机化合物(如蛋白质、酶、多糖、核酸等)水溶液中加入有机溶剂(如乙醇、丙酮等)后，显著降低待分离物质的溶解度从而将其沉淀析出的一种方法。其机理在于溶质(待分离物质)在溶液中化学势发生变化造成溶解度的下降。其优点在于选择性好、分辨率高，因为一种有机化合物往往只能在某一溶剂狭窄的浓度范围内沉淀，溶剂易除去回收，但条件控制不当容易使分离物质(如蛋白质)变性。 影响溶剂沉淀的因素 溶剂选择及其添加量 选择合适的溶剂是溶剂沉淀的关键，溶剂必须是能与水相混溶的有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙醇、丙酮等，其中乙醇最为常用，能沉淀蛋白质、核酸、核苷酸、多糖、果胶和氨基酸等化合物，且安全性最高。同时，不同的有机化合物沉淀所需要的溶剂浓度有不同的要求，使用不同浓度的同一种溶剂，往往可以在混合溶液中起到分级沉淀的效果。 样品的浓度 对于蛋白质样品溶液的沉淀分离，如果样品浓度低一些，可以减少蛋白质之间的相互作用，防止共沉淀现象，但易引起蛋白质变性，另一方面，如果样品浓度高一些，可以减少蛋白变性，有机溶剂的使用量可减少，但控制不当易出现共沉淀现象，一般而言，控制蛋白质起始浓度为5～30mg/mL。 温度 对蛋白质溶液进行溶剂沉淀分离，一般在低温条件下进行，大多数酶和蛋白质的溶解度随温度降低而降低，可以利用温度差进行蛋白质分级沉淀。如果温度过高，促使蛋白质的分子结构松散，使得溶剂分子与一些氨基酸残基产生疏水性结合而引起蛋白质的不可逆变性。 pH值 蛋白质溶液中的溶质溶解度受pH值影响，一般在等电点的溶解度最低，将pH值调节到溶液中多数蛋白质带有相同的静电荷，可减少蛋白质之间的相互作用，防止共沉淀。利用改变溶液的pH值可实现有选择的分段沉淀，另外，pH值与离子强度有协同作用而改变蛋白质的溶解度。 调节离子强度 低浓度的中性盐类增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，并且对蛋白质具有保护作用，防止变性。要将蛋白质从低离子强度的溶液中沉淀出来往往需要更高的溶剂浓度。 盐析沉淀 在较低浓度的盐溶液中，酶和蛋白质的溶解度随盐浓度升高而增大，这称之为盐溶。当盐浓度增大至一定程度后，酶和蛋白质的溶解度又开始下降直至沉淀析出，这称之为盐析。其原理在于中性盐离子对蛋白质分子表面活性基团及水活度的影响结果。蛋白质类化合物的盐析沉淀手段通常有两种：一种是在固定蛋白质溶液的pH值与温度的前提下，添加盐来调节溶液离子强度以达到沉淀蛋白的目的。此法常用于蛋白质粗制品的分级沉淀和酶制剂的制备等。另一种是在一定的离子强度下，调节溶液的pH值或温度以达到沉淀蛋白质的目的，此法适用于蛋白质的提纯精制以及饱和结晶等。 在盐析沉淀条件中，中性盐的合理选择至关重要，根据离子促变序列，多价盐类的盐析效果比单价的效果好，阴离子的效果比阳离子的好。顺序大致如下： 檬酸根酒石酸根PO43－F－IO3－SO42－醋酸根B2O3－Cl－ClO－Br－NO3－ClO－I－SCN－；Th4＋Al3＋H＋Ba2＋Sr2＋Ca2＋；Mg2＋Cs＋Pb＋NH4+K+Na+Li+。 在蛋白质溶液中，一般以硫酸铵、硫酸钠应用最广，选择中性盐时注意添加盐的浓度，避免杂质带来干扰或对蛋白质的毒害。使用带金属离子的盐类时，可考虑添加一定量的金属螯合剂如EDTA等。 蛋白质或酶等物质经盐析沉淀分离后，产品夹带盐分，需脱盐处理。常用的脱盐处理方法有透析法、超滤法、电渗析法和葡萄糖凝胶过滤法等。 影响盐析效果的因素有蛋白质浓度、盐类、离子类型、离子浓度、pH值、温度等。 沉淀剂沉淀 添加某种化合物与溶液中的待分离物质生成难溶性的复合物，从而从溶液中沉淀析出的方法，称为沉淀剂沉淀。添加的化合物称为沉淀剂。沉淀剂沉淀分离主要有金属离子沉淀法、阴离子沉淀法、非离子型聚合物沉淀法以及均相沉淀法等。 ①金属离子沉淀法 蛋白质在碱性溶液中带负电，金属离子与蛋白质中的－COOH、―OH、―NH2、―SH等基团反应生成难溶性的复合盐而析出，根据金属离子与蛋白质的相互作用关系，将金属离子分成以下三类： 与氨基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的金属离子有：Mn2＋、Fe2＋、Co2＋、Ni2+、Cu2+、Zn2+和Cd2+等。 与羧酸结合而不与含氮化合物结合的金属离子有：Ca2+、Mg2+、Pb2+和Ba2+等。 与巯基化合物强烈结合的金属离子有：Hg＋、Ag+和Pb2+等。 金属离子沉淀分离效果除与金属离子的种类、蛋白质的性质、离子化程度以及相互结合的位置等因素有关，沉淀的复合物的溶解度与溶液的介电常数相关，介电常数减小则溶解度降低。一般而言，金属离子浓度调节在0.02mol/L左右。浓度过高，易引起共沉淀，并且产生的静电力可能影响蛋白质的二、三、四级空间结构，引起蛋白质变性。复合物中金属离子的去除，可通过H2S形成硫化物去除或添加螯合剂EDTA。 金属离子沉淀法常有共沉淀现象和吸附作用，同时有一些金属盐的溶解度相对也比较大，因此分离效果受到影响，实践中一般用作初步分离，并且通常是与其他分离方法配合使用。 一些含氮的有机酸如苦味酸、苦酮酸和鞣酸等能与有机分子的碱性基团反应生成难溶性的盐复合物析出，但这种盐复合物沉淀往是属于不可逆反应，引起蛋白质发生变性，因此，需要采取预防蛋白质变性的措施，如采用温和的反应条件，并加入一定量的稳定剂(如抗坏血酸等)。 许多无机杂多酸能与氨基酸、蛋白质作用形成盐类复合物沉淀，如磷钨酸、砷钨酸、硼钨酸、硅钨酸以及磷、砷、硼、硅的钼酸或钒酸等。反应过量的这些无机杂多酸可在无机盐溶液中由萃取出来。 一些非离子型多聚物(如聚乙二醇、葡聚糖和右旋糖酐硫酸钠等)作为沉淀剂，能将溶液的一些有机物质沉淀分离出来，如蛋白质、酶、核酸、细菌、病毒等。 非离子型聚合物沉淀法操作条件温和，不易引起生物分子的变性，少量的沉淀剂就能沉淀大量的生物大分子物质，并且沉淀后的多聚物容易除去。 聚乙二醇(PEG)是应用较多的水溶性的非离子型多聚物，多用于沉淀蛋白质，其沉淀效果除与溶液的离子强度、pH值、温度及蛋白质浓度等因素有关之外，还与沉淀剂本身的分子量及浓度有关，一般而言，聚乙二醇浓度与溶液的离子强度成反比。当pH值越接近蛋白质等电点，所需PEG浓度也越低。同时在一定范围内， PEG的相对分子质量越大沉淀效果越好。 直接将沉淀剂加入溶液中，容易出现局部浓度过大，产生的沉淀物过于细小或者结构疏松，均匀不一，易吸附杂质影响纯度，而借助于化学反应使溶液中缓慢而均匀地产生沉淀剂以获得较纯净的晶形或非晶形沉淀，这就是均相沉淀法，实现均相沉淀通常有以下手段： 1 在溶液中加入能产生沉淀剂的化学试剂，使得通过化学反应均匀产生出沉淀剂。 2利用某些试剂的水解反应使反应溶液的pH值发生变化，使pH值达到一定值时就会生成沉淀。 3 将溶液与沉淀剂在某种能与水混溶的溶剂中混合，再缓慢蒸去溶剂，使之在缓冲条件下实现均相沉淀。 等电点沉淀分离法 等电点沉淀分离法主要是利用两性电解质分子在电中性时溶解度最低，不同的两性电解质具有不同的等电点而进行分离的一种方法。如蛋白质、酶、以及氨基酸等两性电解质，当其整体电荷为中性时，溶解度最小，控制不同的等电点，就能将不同的电解质分离。 变性沉淀 变性沉淀是利用生物大分子(如蛋白质)在变性后溶解度降低而从溶液中沉淀析出，当然轻度变性的蛋白质不一定沉淀出来，变性后蛋白质能恢复原来结构与功能的过程称为可逆变性，反之称为不可逆变性。引起蛋白质变性的因素包括温度、pH值以及其他的化学因素，能引起蛋白质变性的化学试剂有甲酸、乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸等酸类；甲醇、乙醇、甘油等醇类；甲酰胺、N-甲基乙酰胺等酰胺类；以及二脲、盐酸胍、氯仿、酚等，还有表面活性剂如十二烷基磺酸钠(SDS)等，另外，一些酶也会使蛋白质变性。 三 界面力分离 利用混合物的固液、气液或气固相界面之间的传质作用而进行的分离过程，统称为界面力分离，在气液界面上进行的是泡沫分离；在固液界面上进行的是液体吸附，在固气界面上进行的是气体吸附，这两者又统称为吸附分离。 泡沫分离 泡沫分离是以泡沫作为分离介质，以组分之间的表面活性差异作为分离依据，利用气体在溶液中鼓泡来达到浓集物质为目的的一种分离技术，若在分离过程中虽需鼓泡，但不一定形成泡沫层，则称非泡沫分离法，非泡沫分离法又有两种方式，一种是富集了溶液中的表面活性物质(表明活性物质本身就是待分离成分或者是结合了待分离成分)的气泡升到设备顶部与主体溶液分离。这叫鼓泡分离法；另一种是富集了溶液中的表面活性剂的气泡带到顶部被与溶质互不相溶的溶剂吸收从而得到分离，这叫溶剂消去法。 泡沫分离又分泡沫分馏与泡沫浮选两种，泡沫浮选是利用泡沫对微粒、离子、分子、胶体等的表面吸附作用进行浮选分离，泡沫分离是泡沫有选择性地将待分离成分吸附，泡沫层浮在溶液上部，然后将泡沫收集并进行消泡处理。 泡沫分离必须有两个条件： 一是有很大的气液接触表面； 二是待分离的物质具有表面活性，并且溶液中各组分的表面活性要有差异。 当溶液中要分离的是具有表面活性物质时，可直接通入空气泡，表面活性物质就会在空气泡表面浓集，并随空气泡上浮在液体表面从而得到分离，当待分离的物质不具有表面活性时，可加入表面活性剂，通过螯合、静电吸引等作用与之形成具有表面活性的结合体进行分离。 泡沫是气体分散在液体中的多相非均匀体，是由液体薄膜包围的气体，是气液相间的产物。泡沫的生成及其稳定性与溶液和气体性质有关，气体可以是液体溶解组分，可以是化学反应产生，或者是从外界鼓进。 气体在液体中的溶解度很小或很大都影响持泡性，泡沫形成有物理起泡法和化学气泡法两种，物理气泡有机械作用(如搅动、强制对流等)气动鼓泡法、变压法等；化学起泡法有化学起泡(加化学试剂使之反应生成气体)，电解起泡和发酵起泡等。 形成的气泡和气泡群有多种堆积方式，其中三气泡堆积结构(三个气泡之间的液膜拉成互为120℃的三角柱体)是最为稳定的，其他不稳定结构不断变化，有过渡到三泡结构的可能，也有破灭的可能。影响气泡生成、成长与稳定性的因素很多，主要有组分的性质、浓度、温度、压力和pH值等，这个因素通过影响溶液的黏度、表面张力和气泡的大小而影响气泡的稳定性，一般而言，有机物的水溶液中的泡沫稳定性比在无机物水溶液的稳定性更好；泡沫的稳定随温度上升而下降，随黏度上升而上升，但黏度大到一定程度，不利于气泡的产生、富集、上浮和分离；气泡的表面积大，稳定性小，气泡寿命与气泡的直径平方成反比。 影响泡沫分离效果的因素也很多，各种影响因素在分离中的重要性在不同的分离体系中是不同的，取决于分离体系本身的性质(如溶液中表明活性剂与助剂的性质、浓度、pH值、温度、黏度等)和分离过程的操作参数(如气体流速、料液流速、回流比、泡沫层高度、密度操作压力、气泡大小、泡沫排出方式等)。 泡沫分离技术设备简单，能耗低，常温或低温下操作，适用于热敏性物料和化学不稳定性成分(如蛋白质和酶)，还特别适用于低浓度组分的浓缩和回收，如从发酵液中回收生物大分子或生物制品等，同时泡沫分离技术也存在许多不足之处，如捕集剂难于回收，消耗量大；泡沫塔返混现象严重，影响分离效率。泡沫分离法一般被认为是一种粗略分离，往往需要与别的分离法配合使用。 参数泵分离 参数泵分离技术是一种新型的吸附分离技术。溶质在一根柱内的固定相和流动相之间进行分配。在一定的条件下，吸附和解吸速率达到一定等值时，溶质在固相和液相的分配达到平衡。如果溶质分配过程改变热力学参数(如温度、浓度、压力和pH值等)就改变了包括溶质在固相的吸附量和在液相中的溶解量。事实上包括各种振荡场(如热电磁、化学位等)都可以用作改变溶质分配的推动力。利用热力学参数周期性变化，同时控制柱内的流动相自下而上、自上而下的周期性流动，经过多次循环，溶质在柱内的固定相上的吸附不断变化而形成浓度梯度，在一端增浓而在另一端稀释从而得到分离，这就是参数泵分离。 其优点是可以达到很高的分离程度，其中以温度作为变化参数的称为热力参数泵，以压力作为参数的称为无热源参数泵，以pH值为变化参数的参数泵已有研究用来提纯分离蛋白质。 热参数泵 以温度为热力学参数的热参数泵，温度控制有两种操作方式：一种是由送入夹套的热水或冷水将柱子(或固定床)的温度升高或下降，使固定相和流动相的温度发生变化，这称为“直接式”；另一种是在吸附柱的两端各连接一个热交换器，流动相未进入柱内前先在热交换器内加热或冷却，然后送入吸附柱内，这称为“同流式”。 以“直接式”为例的热参数泵分离操作过程如下：外部带有夹套的内部装有固定相填料的柱子(固定床)吸附柱两端各接有贮槽，夹套内通入冷热水或加热，为了使流动相在柱内能上下流动，柱两端有泵送装置。溶液的上下流动方向改变与柱的加热或冷却过程同步。 在前半循环周期时柱受热，流动相向上移动；后半循环周期时柱冷却，流动相向下移动，假设流体混合物由易吸附组分和难吸附组分组成，则在较高温度下吸附剂对溶质(易吸附组分)的吸附容量减少，吸附剂释放的溶质随向上流动的流动相上升； 在后半循环周期，柱体受冷却吸附剂的吸附容量增加，溶质固定于吸附剂(固定相)填料层较高的位置，在填料层形成一定的浓度梯度，溶质在柱顶贮槽内浓度增加，在柱底贮槽内浓度减少，而难吸附组分情况恰好相反。随着循环次数的增加，将混合物液中的目标分离对象更加分开。 变压吸附分离 用压力作热力学参数，利用压力的改变造成吸附剂对溶质吸附容量的改变而达到分离的目的的无热源参数泵分离，这就是变压吸附分离。其原理就是利用被吸附气体的压力周期性变化，在高压下吸附，在低压或真空下解吸，吸附剂同时再生，从而将混合的气体组分分离。 变压吸附按照压力的变化有三种操作方式：常压下吸附、真空下解吸；高压下吸附，常压下解吸；加压下吸附，真空下解吸。 思考题： 1理想的溶剂必须具备什么条件？ 2 对于某一可通过结晶提纯的成分如何通过实验确定适合其结晶的溶剂体系？ 3结晶的操作步骤主要有哪些？ 四 结晶法 结晶是提纯固体化合物的一种重要方法，它适用于产品与杂质性质差别较大，产品中杂质含量小于5%的体系。固体有机物在溶剂中的溶解度与温度有密切关系。一般是温度升高溶解度增大。若把固体物质溶解在热的溶剂中达到饱和，冷却时由于溶解度降低，溶液变成过饱和而析出结晶。一般地讲，一个固体达到了一定的纯度，在一定条件下，就会出现结晶。利用溶剂对被提纯物质及杂质的溶解度不同，可以使被提纯物质从过饱和溶液中析出。而让杂质全部或大部分仍留在溶液中(或被过滤出去)从而达到提纯目的。一般能结晶的物质大部分是比较纯的化合物，有时结晶也是混合物，即使这样，也还是可以和不结晶的部分分开。 将不是结晶状物质处理得到结晶状物质，叫结晶。将不纯的结晶用结晶方法精制得到较纯的结晶称为重结晶。 在植物提取分离时，有时找到合适的溶剂进行提取，提取液稍一浓缩就有结晶析出。例如用乙醇将橘皮回流提取橙皮苷，在连续回流提取时就有橙皮苷结晶析出。但一般提取所得到的往往是糖浆状、半固体或固体粉末，所以从粗产物直接结晶是不适宜的，必须先采用其他方法进行初步提纯，例如萃取、水蒸气蒸馏、减压蒸馏等。然后再用结晶提纯。 应用结晶法提纯有机化合物是利用要提纯分离的化合物与其他化合物在有机溶剂中的溶解度差异及其与温度的依赖关系不同，使要提纯分离的化合物从其粗品混合物中分离出来。 结晶法分离精制的关键是正确选择溶剂和选择结晶的条件。 结晶分离法操作方便，所用仪器简单，是有机化合物分离首选方法。但只有符合以下条件的混合物才能用结晶法进行分离。 (1)有效成分在欲结晶的混合物中的含量一般来说，含量越高越易结晶，有的化合物需要较纯时才能结晶；有的虽含量不高，但如果条件选择得当，也可以得到结晶。 (2)合适的溶剂条件 有时化合物含量很高，因溶剂选择不当，也得不到结晶；有时含量不高，因选择了合适的溶剂，也能得到结晶，因此合适的溶剂很重要。如果结晶所用溶剂为单一溶剂，通常需要的溶剂对要结晶化合物的溶解度不能小，也不能太大。 (3)要结晶的化合物在所选溶剂中的浓度 一般来讲，浓度高些容易结晶；但浓度过高时，相应的杂质的浓度或溶液的黏度也增大，有时反而阻止结晶的析出。实际工作中有时将较稀的溶液放置，到溶剂自然挥发到适当的浓度和黏度，即能析出结晶。 (4)合适的温度和时间 一般温度低些较好，有时在室温下不能结晶时，可以放置在冰箱或阴凉处。而且结晶的形成常需要较长时间，因此经常需要放置，甚至有时需要放置3~5天或更长时间。 (5)制备衍生物 某些化合物即使很纯，也不易结晶，而其盐或乙酰衍生物(如含－OH等基团化合物)等却易于结晶,这样可以先把要结晶的物质制备成衍生物再结晶，得到结晶后再还原。 结晶溶剂的选择 结晶时，选择理想的溶剂是一个关键，理想的溶剂必须具备下列条件。 不与被提纯物质起化学反应。 选择性好。被提纯物质在溶剂中的溶解度对温度有较强的依赖性，温度升高，溶解度较大；在较低的温度(如室温)下，被提纯物质溶解度较小。 其他杂质在溶剂中的溶解度对温度的依赖性小，对杂质的溶解度非常大或非常小(前一种情况是使杂质留在母液中不随提纯物晶体一同析出，后一种情况是使杂质在热过滤时被除去)。 易于回收。通常溶剂的回收精制采用精馏方法，因此溶剂的沸点应相对较低。易于结晶分离出去，一般要求溶剂的沸点低于结晶的沸点。 溶剂应使被提纯物质易成核，生成的晶体应较完善，结晶产品的纯度高，以利于固液分离，因此所选溶剂的黏度要小，能给出较好的结晶。 同一种化合物在不同的溶剂中所得晶形不同。在几种溶剂同样合适时，则应根据结晶的回收率、晶形、操作的难易、溶剂的毒性、易燃性和价格来选择。 溶剂的选择先通过查阅文献，参考同类型化合物的一般溶解性质和结晶条件。一般来说，生物碱可溶于苯、、氯仿、乙酸乙酯和丙酮，苷类溶于各种醇、丙酮、乙酸乙酯,氯仿等。氨基酸常用甲醇或乙醇来结晶等。 如果在文献中找不到合适的溶剂，可根据要结晶化合物的极性大小，利用相似相溶的溶解度规则，通过实验选择溶剂。其方法是:取0.1g的产物放入一支试管中，滴入1ml溶剂，震荡下观察产物是否溶解，若不加热很快溶解。说明产物在此溶剂中溶解度太大，不适合作此产物重结晶的溶剂；若加热至沸腾还不溶解，可补加溶剂，当溶剂量大于4ml产物仍不溶解时，则说明此溶剂也不适宜。如所选择的溶剂能在1~4ml，溶剂沸腾的情况下使产物全部溶解，并在冷却后能析出较多晶体，说明此溶剂适合作为此产物重结晶的溶剂。 实验中应同时选用几种溶剂进行比较。有时很难选择到一种较为理想的单一溶剂，这时应考虑使用混合溶剂。 所谓混合溶剂，就是把对此物质溶解度很大的和很小的而又能互溶的两种溶剂(例如水和乙醇)混合起来，这样常可获得新的良好的溶解性能。用混合溶剂重结晶时，可先将待纯化物质在接近良溶剂的沸点时溶于良溶剂中(在此溶剂中极易溶解)。若有不溶物，趁热过滤；若有色，则用活性炭煮沸脱色后趁热过滤。于此热溶液中小心地加入热的不良溶剂(物质在此溶液中溶解度很小)，直至所呈现的混浊不再消失为止。再加入少量良溶剂或稍稍加热使恰好透明。然后将混合物冷却至室温，使结晶自溶液中析出。有时也可将两种溶剂先行混合，再进行结晶。如1:1的乙醇和水，其操作和使用单一溶剂时相同。 结晶的操作步骤 1.制备提纯物的饱和液 这是结晶操作过程中的关键步骤。其目的是用溶剂充分分散产物和杂质，以利于分离提纯。一般用锥形瓶或圆底烧瓶来溶解固体。若溶剂易燃(不能用明火加热)或有毒时，应装间流冷凝器。加入沸石和已称量好的粗产品，先加少量溶剂，然后加热使溶液沸腾或接近沸腾，边滴加溶剂边观察固休溶解情况，使固体刚好完全溶解，停止滴加溶剂，记录溶剂用量。再加入20%左右的过量溶剂，主要是为了避免溶剂挥发和热过滤时因温度降低，使品体过早地在滤纸上析出造成产品损失。溶剂用量不宜太多，否则会造晶体析出太少或根本不析出，此时，应将多余的溶剂蒸发掉，再结晶冷却。有时总有少量固体不能溶解，应将热溶液倒出或过滤，在剩余物中再加入溶剂，观察是否能溶解，如加热后缓慢溶解，说明此产品需要加热较长时间才能全部溶解。如仍不溶解，则视为杂质去除。 2 脱色 粗产品中常有一些有色杂质不能被溶液去除，因此，需用脱色剂脱色。最常用的脱色剂是活性炭，它是一种多孔物质，可以吸附色素和树脂状杂质，但同时它也可以吸附产品，因此加入量不宜太多，所加活性炭的量，视杂质多少而定，一般为粗产品质量的1%~5%。具体方法:待上述热的饱和溶液稍冷却后。加入适量的活性炭摇动，使其均匀分布在溶液中加热煮沸5~10min即可。注意!千万不能在沸腾或近沸的热溶液中加入活性炭，否则会引起暴沸，使溶液冲出容器造成产品损失。在非极性溶剂如苯、石油醚中，活性炭脱色效果不好，可试用其他方法如氧化铝吸附脱色。 3 热滤(做到两热一快) 目的是去除不溶性杂质，为了尽量减少过滤过程中晶体的损失，操作时应做到仪器热 (将所有的仪器用烘箱或气流烘干器烘热待用) 、溶液热、动作快。过滤一般采用常压热过滤(重力过滤)和减压热过滤(抽滤)。 4 冷却结晶 冷却结晶是使产物重新形成晶体的过程，其目的是进一步与溶解在溶剂中的杂质分离。热的饱和溶液冷却后，晶体可以析出。当冷却条件不同时，晶体析出的情况也不同。为了得到形状好，纯度高的晶体，在结品析出的过程中应注意以下几点。 应在室温下慢慢冷却至有固体出现，再用冷水或冰进行冷却，这样可以保证晶形状好，颗粒大小均匀，晶体内不含有杂质和溶剂。否则，当冷却太快时会使晶体颗粒太小，晶体表面会从液体中吸附更多的杂质，加大洗涤难度。当冷却太慢时，晶体颗粒有时太大(超过2mm)，会将溶液夹带在里边，给干燥带来一定的困难。因此，控制好冷却速度是晶体析出的关键。在冷却结晶过程中，不宜剧烈摇动或搅拌，这样会造成晶体颗粒太小。当晶体颗粒超过2mm时，可稍微摇动或搅拌几下，使晶体颗粒大小趋于平均。 有时滤液已冷却，但晶体还未出现，可用玻璃棒摩擦瓶壁促成晶体形成，或取少量溶液，使溶剂挥发得到晶体，再将该晶体作为晶种加入到原溶液中，液体中一旦有了晶种或晶核，晶体将会逐渐析出。晶种的加入量不宜过多，而且加入后不要搅动，以免晶体析出太快，影响产品的纯度。 如溶液中析出的是油状物，此时，进一步冷却可以使油状物成为晶体析出，但其含杂质较多，应重新加热溶解，然后慢慢冷却，当油状物析出时，剧烈搅拌可使油状物在均匀分散的条件下固化，如还是不能固化，则需要更换溶剂或改变溶剂用量，再进行结晶。 对于在常温难于结晶的物质，可以把溶液放在冰箱中冷却，使晶体析出。 5 抽滤－真空抽滤 抽滤的目的是将留在溶剂(母液)中的可溶性杂质与晶体(产品)彻底分离。其优点是过滤和洗涤速度快，固体与液体分离的比较完全，固体容易干燥。常采用减压冷过滤得到固体。在晶体抽滤过程中应注意以下几点。 应用母液转移转移瓶中的残留晶体，不能用新的溶剂转移，以防溶剂将晶体溶解造成产品损失。用母液转移的次数和每次母液的用量都不宜太多，一般2-3次即可。 晶体全部转移至漏斗中后。为了将固体中的母液尽量抽干，可用玻璃钉或瓶塞挤压晶体。当母液抽干后，将安全瓶上的活塞打开使之与大气相通，向布氏漏斗中加入少量溶剂洗涤晶体，再将溶剂抽干同时进行挤压。这样反复2-3次，将晶体吸附的杂质洗干净。晶体抽滤洗涤后，将其倒入表面皿中进行干燥。 6 结晶干燥，测定熔点。 为了保证产品的纯度，需要将晶体进行干燥，把溶剂彻底去除。当使用的溶剂沸点比较低时，可在室温下使溶剂自然挥发达到干燥的目的。当使用的溶剂沸点比较高(如水)而产品又不易分解和升华时，可用红外灯烘干。当产品易吸水或吸水后易发生分解时，应用真空干燥器进行干燥。干燥后测熔点，如发现纯度不符合要求，可进行重结晶操作直至熔点不再改变为止。 重结晶 如果第一次结晶所得晶体纯度不够，可以进行重结晶。 重结晶的操作步骤与结晶的操作步骤基本相同。所用的溶剂也可以参考结晶用溶剂，但也经常改变。因物质成为结晶后和原来在混杂状态下的溶解度不同，有时还需要经过小量试验再确定溶剂。选择溶剂时同时还要考虑粗结晶中的杂质的性质，有时还需要用两种不同的溶剂分别重结晶才能达到纯净的结晶，即先用一种溶剂或混合溶剂重结晶除去一种杂质。再用另一种溶剂重结品除去其他杂质。 分步结晶 在天然有机化合物的提取中有时可用分步结晶的方法得到多种结晶。具体操作是将粗结晶溶于选择好的溶剂中，经结晶处理后析出结晶Ⅰ，过滤分离出结晶Ⅰ；结晶Ⅰ后的母液再经浓缩或冷却再析出结晶Ⅱ；母液再经浓缩或冷却再析出结晶Ⅲ。结晶Ⅰ和结晶Ⅱ经检查如为同一物质且纯度相同就合并，如不是同一物质或是同一物质但纯度不同，则分别处理。一般分步结晶时，第一步所得结晶纯度要比第二步结晶的纯度好，分步结晶有利于得到纯度更高的结晶。 如何检查分步结晶的产物是同种物质？其纯度如何判断？ 微量重结晶 在天然有机化合物的重结晶操作中，常常会遇到所要结晶的物质的量很少的情况，这时往往需要用微量重结晶方法来特殊处理结晶过程。如粗乙酞苯胺的微量重结晶操作过程为： 在50mL圆底烧瓶中加入计量的水和两粒沸石，在烧瓶上装上50mL或100mL恒压漏斗，漏斗中装入事先铺有一层活性炭及一层待纯化的粗乙酞苯胺的菊花状滤纸，在恒压滴液漏斗的上方安装一球型冷凝管。接通冷凝水后开始加热回流，溶剂蒸气经恒压滴液漏斗的支臂到达球形冷凝管，冷却后滴下与固体样品接触将其溶解，进入圆底烧瓶中，这样经无数次地溶解、回流，直至样品完全溶解，在加热回流过程中要打开恒压滴液漏斗的活塞，以便造成一定的直气流和支气流的气流比，从而提高溶解温度，加快溶解速度。样品完全溶解后停止加热，待烧瓶冷却完全析出晶体时，用玻璃钉漏斗分出此晶体，烘干。 本方法进行的重结晶操作样品损失少，产率高，所得结晶纯度高；溶剂用量小，所用时间短。适合微量化合物的重结晶操作。

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