现 代 分 离 科 学 1 2010 VOL 27 ： 467-479 关于反胶团萃取的研究 （ 陕西师范大学化学与材料科学院 刘瑞林 710062 ） 摘要 ：本问介绍了反胶团萃取的基本概念及其影响反胶团萃取蛋白质的因素，并分 析了动力学和热力学的理论，从而建立了平衡模型。 关键词 ：反胶团、萃取、平衡模型 1．研究背景 传统的分离方法，如液 -液萃取技术，具有操作连续、多级分离、放大容易和便 于控制等优点，在化学、化工、石化等领域得到广泛应用。但很难用于具有某些特 殊性质的生化产品 (如蛋白质、氨基酸等 )的提取与分离，原因在于这类物质多数不 溶于非极性有机溶剂，或与有机溶剂接触后会引起变性和失活。 20世纪 80年代中期发展起来的反胶团萃取技术解决了这一难题。所谓反胶团， 是指当油相中表面活性剂的浓度超过临界胶束浓度后，其分子在非极性溶剂中自发 形成的亲水基向内、疏水基向外的具有极性内核 (polar core)的多分子聚集体 (aggregates)。反胶团的极性内核可以溶解某些极性物质，而且在此基础上还可以溶 解一些原来不能溶解的物质，即所谓二次加溶原理。例如，反胶团的极性内核在溶 解了水后，在内核中形成“水池” (water poo1)，可以进一步溶解蛋白质、核酸和氨 基酸等生物活性物质。胶团的屏蔽作用，使这些生物物质不与有机溶剂直接接触， 而水池的微环境又保护了生物物质的活性， 从而达到了溶解和分离生物物质的目的。 这种技术既利用了溶剂萃取的优点，又实现了生物物质的有效分离，作为一种新型 的生物分离技术应用于蛋白质、氨基酸及药物、农药等物质的分离分析中，显示了 巨大的应用潜力。 [1] 2 ．文献综述 2.1反胶团的形成 [2] 正向胶团 (normal micelle)是表面活性剂分子在极性溶剂，如水中形成的一种亲 水基团 (头)朝外，而疏水基团 (尾)朝内的具有非极性内核的多分子聚集体。 洗涤剂中 的表面活性剂分子在水中形成的就是这种胶团，其非极性内棱可以溶解各种油污。 从而达到去污的效果。与此相反，表面活性剂在非极性溶剂如某些有机溶剂中就会 形成亲水头向内和疏水尾向外的具有极性内核 (polar core)的多分子聚集体 (aggregates)，由于其表面活性剂的排列方向与一般的正向胶团相反，因此，称为反 现 代 分 离 科 学 2 2010 VOL 27 ： 467-479 胶团。示意图如图（ 2 －1）。 图2 －1 表面活性荆分子在非极性溶荆中形成的反胶目 反胶团的极性内核可以溶解某些极性物质，而且在此基础上还可以溶解一些原 来不能溶解的物质， 即所谓二次加溶原理。 例如，反胶团的极性内核在溶解了水后， 在内核形成了“水池” (water pool)，可以进一步溶解蛋白质、核酸、氨基酸等生物 活性物质。由于胶团的屏蔽作用，使这些生物物质不与有机溶剂直接接触，而水池 的微环境又保护了生物物质的活性，达到了藩解和分离生物物质的目的。图 2－2是 解释此过程的一种常用的模型一“水壳模型”的示意图。 图2 －2 利用反胶团特蛋白质溶解于有机溶荆中的水壳模型 这种技术既利用了溶剂萃取的优点，又实现了生物物质的有效分离，成为一种 新型的生物分离技术。 2.2 反胶团及其萃取原理 反胶团是表面活性剂溶解在有机溶剂中形成的纳米级聚集体，是一种透明、稳 定的热力学体系。反胶团中表面活性剂非极性头向外与有机溶剂接触，极性头向内 形成极性核，极性核溶入水后形成微“水池”。反胶团的一个重要参数是它的含水 量 ( “水池” 中溶入的水与表面活性剂的摩尔比， W0)，它决定反胶团的尺寸。在 W 10时[3] ，水分子被束缚在反胶团的壁上，它的凝固点下降、共价键参数改变、 0 现 代 分 离 科 学 3 2010 VOL 27 ： 467-479 氢键破坏；只有在 W 。较大时，才存在自由水。当含反胶团的有机溶剂和蛋白质水 溶液接触时，蛋白质在某种作用力 (静电、亲和、疏水 )下进入“水池”中，水和表 面活性剂分子在蛋白质周围形成一个保护层，使蛋白质避免与有机溶剂接触，不致 失活。 2.3 反胶团萃取蛋白质的影响因素 蛋白质的萃取受很多因素影响，这些因素包括原料液的 pH值、离子强度、表面 活性剂和有机溶剂种类等：蛋白质等电点、亲水性、电荷密度及分布也是影响其萃 取的重要因素。 2.3.1 表面活性剂 表面活性剂是反胶团萃取的一个关键因素，不同结构的表面活性剂形成的反胶 团含水量和性能有很大差别。通常希望所选表面活性剂形成极性核较大的反胶团， 且反胶团与蛋白质的作用不应太强，以减少蛋白质的失活。最常用的是阴离子表面 活性剂丁二酸 (二 )-2-乙基己基酯磺酸钠 (AOT) ，它形成反胶团时，不需要加入助剂。 AOT 反胶团体系适宜于萃取小分子量 (分子量 30kDa)蛋白质 (如溶菌酶、胰蛋白酶、 细胞色素 C等 )。Somnuk等[4] 用AOT- 异辛烷体系进行了从发酵液中提取细胞色素 C、 溶解酵素、核糖核酸酶 A 的试验，结果三种酶的最终萃取率在 70％~97％之间，并发 现酶在原料液中的初始浓度对萃取率 [萃入有机相的蛋白质浓度 (或质量 )与原料相中 蛋白质浓度 (或质量 )的比值 ]没有影响。 Ludger[5] 等用同一反胶团体系在 Graesser接触 器中对溶解酵素和细胞色素 C进行提取，40min后，两者的萃取率都在 95％以上。AOT 反胶团体系对于分子量较大 ( 胃蛋白酶、血红蛋白、血清蛋白等 ) 的蛋白质萃取率很 低，且易在两相界面形成不溶性凝聚物 [6,7] 。分子量大，蛋白质的体积就大，传递过 程中障碍也大，所以萃取率相对的小。 Goto[8] 等合成了一系列双油基磷酸型 (DOLPA 、 DTDPA 、DEPTA) 表面活性剂。他们发现， DTDPA 反胶团体系对溶解酵素和细胞色 素C的萃取率近乎 100％，对血红蛋白 (HB) 的萃取率为 80％；而同一条件下 AOT 反胶 团体系对 HB的萃取率仅为 16％，且在两相界面上有红色不溶凝聚物出现。 结果表明， 决定蛋白质萃取率的一个关键因素是表面活性剂的疏水基结构， 由于表面活性剂的 疏水基和蛋白质的疏水部位问的作用，可显著提高蛋白质萃取率。为使大分子蛋白 质溶入反胶团，所用表面活性剂有较强的疏水性是必要的， DTDPA 疏水基比 AOT 大，对蛋白质的输水部位作用较强，所以对血红蛋白有较好的萃取。 Long等[9] 用 DEPTA-异辛烷萃取血红蛋白的试验。结果表明，原料相中血红蛋白浓度为 0.5mg/mL 、KC1为0．2mol/L ， 有机相中 DEPTA为0.02mol/L 时， HB 的萃取率在等 电点附近达到 97 ％；经紫外检测，反萃后的 HB与原料相的 HB谱峰无显著差异，表 现 代 分 离 科 学 4 2010 VOL 27 ： 467-479 明HB仍保持较高的活性。 常用的阳离子表面活性剂有三辛基甲基氯化铵 (TOMAC) 、 十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 、十二烷基苯基氯化铵 (DMBAC) 、Aliquat366 等铵盐； 利用非离子表面活性剂形成反胶团的研究很少，主要有 Span-60、Tween-80等。 向单一反胶团体系中加入助表面活性剂或导入亲和试剂形成复合反胶团体系， 这样能显著提高反胶团的选择性和蛋白质的萃取率。近年来，复合反胶团体系研究 的较多。 Koichiro[10] 等采用 AOT-TOA( 长链烷基胺 )混合反胶团体系萃取溶菌素酶和 牛血清蛋白 (BSA) 的研究。AOT/TOA 体系与酸性原料液混合时， TOA 与HB结合形成 阳离子铵盐，铵盐能和极性头带负电的 AOT 作用形成复合物，从而改变反胶团的性 能。他们发现，对于溶菌素酶， AOT 和 AOT-TOA 的萃取率相近。在 pH5 时，AOT 体系在界面和水相中有不溶物出现，这是由于强烈的静电作用，溶菌素酶和 AOT 结 合形成凝聚物所致， AOT-TOA 无此现象。 AOT 反胶团体系在较宽的 pH范围内对大 分子蛋白质 BSA的萃取率很低，且有凝聚物出现。 AOT-TOA 对BSA 的萃取率在 90％ 以上，这说明 TOA 的加入改变了 AOT 与 BSA之间的作用力 (静电或疏水 ) ，抑制了凝 聚物的形成。严勇朝 [11] 等用TRPO-AOT 萃取牛血红蛋白时发现，混合反胶团的萃取 能力高于单纯的 AOT ，前者在 pH较宽范围内保持很高的萃取率。 DLS(动力光散射仪 结果证实， TRP0使AOT 反胶团变大，从而提高其萃取容量。 2.3.2 亲和助剂 在反胶团中导入与目标蛋白有特异亲和作用的助剂可形成亲和反胶团。亲和助 剂的极性头是一种亲和配基，可选择性地结合目标蛋白，该系统使蛋白质的萃取率 和选择性大大提高。 而且可使操作参数 (如pH值、离子强度 ) 的范围变宽。 Zhang等[12] 采用 CTAB- 己烷反胶团系统，以色素 Cibicaron Blue 3GA (CB) 为亲和配体，发现在 等电点附近， CB为1.6mmol/L时， BSA 的萃取率由 7.88％提高到 63 ％，并使可发生 萃取的 pH范围增大。在等电点附近，反胶团和蛋白质的静电作用很弱， CB 的加入 说明亲和作用是 BSA萃取率提高的主要因素。 Motonari[13] 等向C10E4反胶团中导入 胰岛素抑制剂作为亲和配体，成功地从胰液素中提取出胰岛素，并抑制了胰岛素的 自身降解。 C10E4是非离子表面活性剂，对亲水性蛋白质的静电作用很小，抑制剂 的亲和作用是该过程的主要动力。研究表明 [14,15] ，亲和反胶团体系具有很好的开发 应用前景。 2.3.3 水相 pH值 pH值对蛋白质萃取过程的影响主要体现在改变蛋白质的表面电荷上。 一定条件 下，当原料相 pH值小于蛋白质的等电点 (PI)时，蛋白质表面带正电，如选用的反胶 团内核带负电，蛋白质会在静电作用下由水相转入反胶团相，从而实现不同 PI的蛋 现 代 分 离 科 学 5 2010 VOL 27 ： 467-479 白质分离。一般说来，不同蛋白质达到最大萃取率时原料液 pH值偏离蛋白质 PI的程 度不一样，但 pH偏离 PI较远时，由于强烈的静电作用，表面活性剂吸附于蛋白质表 面，在两相界面形成蛋白质一表面活性剂不溶凝聚物，蛋白质变性严重。 2.3.4 离子强度的影响 离子影响蛋白质表面电荷的分布及表面活性剂的电离程度，一个重要因素是萃 取过程中随蛋白质一起进入反胶团极性核的离子会产生“屏蔽”作用，减小表面活 性剂极性头之间的相斥力，反胶团变小，性能改变。 Yashhiro等[16] 采用AOT- 异辛烷 体系研究了不同离子对溶菌素酶的萃取情况。 结果发现， 对KC1-KC1( 原料相和反萃 相的盐的种类 )体系，溶菌素酶能成功被萃取和反萃；对 NaC1-KC1体系，虽然形成 的反胶团尺寸较大，但在界面出现了不溶性凝聚物，不利萃取；对 KC1-BaC1 体系， 2 2+ 2+ 由于Ba 与表面活性剂的极性头问的强烈静电作用， Ba 聚结在反胶团极性核内， 2+ 反胶团最小。表面活性剂、 Ba 、蛋白质形成复杂的凝聚物，无法完成溶菌素酶的 萃取。通常，随着离子强度的增大，蛋白质与反胶团内核的静电作用变弱，萃取率 减小。 Giordana等[17] 用AOT 反胶团萃取。一糜蛋白酶时发现所选离子种类 (NaC1， 2 KC1 ，LiC1 ，CaC1 )和浓度对萃取率均有显著影响。 随离子强度增大， 萃取率降低； 相同萃取率时对应各种离子强度也有显著差别。 离子强度最小为 0.08mol/L 。Li +最 大为 1.2mol/L 。Andrews 等用同样的反胶团体系考察了核糖核酸酶 A 等四种蛋白质的 萃取情况。结果表明，随离子强度 ( K+ ，Na+ )增大，四种蛋白质的萃取率均减小， + + + 当原液相中为 K 时，萃取率减小趋势比 Na 快的多，这说明半径较大的 K “屏蔽 ”作 用较强，使蛋白质和反胶团间的作用力减小较快。对于疏水性强的蛋白质，由于它 和表面活性剂及有机溶剂的强烈疏水作用，萃取率受离子强度影响也小。 2.3.5 其它因素 温度是影响反胶团提取蛋白质的另一重要因素，温度升高使反胶团含水量 W0 下降，不利于蛋白质的萃取；因此升高温度可以实现蛋白质的反萃取，由于蛋白质 对温度变化较为敏感，所以这种方法值得探讨。蛋白质的溶解方法 [18] 及其在原液相 中的初始浓度也是影响其萃取的重要因素。蛋白质的溶解通常有三种方法：蛋白质 的缓冲溶液直接注入反胶团相中：反胶团溶液与固相蛋白质粉末接触将蛋白质引入 反胶团；蛋白质水溶液与反胶团相混合，蛋白质转移到反胶团中。第三种方法相对 较慢，形成的最终体系是稳定的，它是反胶团技术用于生化分离的基础，是今后研 究的重点。 2.4 理论研究进展 现 代 分 离 科 学 6 2010 VOL 27 ： 467-479 2.4.1 热力学研究 [19] 根据热力学基本理论，蛋白质从水相萃入反胶团相中达到平衡状态时所对应的 系统的 Gibbs 自由能变化应为最小。 由于对引起蛋白质萃取前后系统自由能变化的认 识不同，从而有不同的热力学模型。 Bratko等人采用所谓的“壳 -核”模型研究蛋白 质萃取过程的热力学，假设反胶团为球形，反胶团内表面光滑且电荷沿内表面均匀 分布。考虑了静电作用及蛋白质由水相进入反胶团相中的理想混合引起的自由能变 化。其中静电作用自由能一项通过分别求解未萃人蛋白质前的“空”反胶团与含蛋 白质的“实”反胶团及水相蛋白质胶体溶液的 Poisson-Boltzmann方程获得。该模型 的缺点是假设“空”和“实”的反胶团具有相同的大小，且不随离子强度及 pH 的 变化而改变。但是许多实验表明，正是反胶团的大小随离子强度等的变化才导致了 蛋白质分配平衡特性的改变。 Beuno等人提出了一个简化的热力学模型来预测“空” 和“实”的反胶团的大小。该模型假设系统的自由能的贡献主要来自于蛋白质和反 胶团的内表面的静电作用及由蛋白质进入反胶团中引起的反胶团体积变化而致的熵 变及自由离子的重新分配引起的熵变。 根据该模型能够较好的解释离子强度及 pH对 萃取过程的影响，但模型中用到的一些特性参数目前无法获得。 Rahaman等人也提 出了一个热力学模型，研究了萃人蛋白质前后反胶团的大小与离子强度，蛋白质的 净电荷及尺寸，蛋白质的浓度及含水量等因素的关系。模型假设系统的自由能变化 由三部分组成：蛋白质与表面活性剂及表面活性剂与表面活性剂之间的静电作用； “空”和“实”的反胶团在有机介质的理想混合；相邻的表面活性剂尾部的空间相 互作用。根据该模型，反胶团在萃入蛋白质前后其体积可能变大或变小，这要根据 二者间的相互作用情况而定。反胶团内部及蛋白质与反胶团间的静电作用是使蛋白 质溶解的主要推动力；由于处于反胶团中的蛋白质的屏蔽作用可有效地降低静电作 用自由能，从而使带有与反胶团内表面同种电荷的蛋白质也有可能被溶入反胶团中。 以上这些热力学模型都是在假设反胶团呈球形，每个反胶团内只能包埋一个蛋白质 分子的前提下推导的。由于反胶团的细微结构及蛋白质与反胶团间相互作用的复杂 性，至今为止，还没有一个一致公认的较为准确的热力学模型。根据现有模型，只 能对蛋白质的萃取 /反萃过程的行为给予定性的或半定量的预测。 2.4.2 动力学研究 [19] Dekker等人以三辛基甲基氯化铵 (TOMAC)/ 异辛烷反胶团体系萃 反萃取 α-淀 粉酶为例， 研究了反胶团萃 反萃取蛋白质过程的动力学。 结果表明， 蛋白质的萃取 与反萃取过程的动力学有非常显著的差异； 水相 pH值和离子强度的变化都会影响萃 取和反萃取过程的速率，相对而言，对萃取过程的影响更为强烈；萃取速率一般要 现 代 分 离 科 学 7 2010 VOL 27 ： 467-479 比反萃取速率大好几个数量级。在萃取过程中，传质阻力主要集中在靠近油一水界 面的水相边界层，界面阻力通常可以忽略。而在反萃取过程中，传质阻力主要集中 在油水界面上。他们推测，反胶团在界面的凝结过程可能是反萃取过程的速率控制 步骤，也包含着蛋白质与其周围的表面活性剂带电层的静电作用对于凝结过程有强 烈的影响这样一个观点。 Cristina ，Naoe 和Viparelli 等人的研究都表明，在反胶团 体系中，微胶囊化的酶的化学催化反应都遵循经典的米氏动力学方程，且对酶起决 定作用的动力学常数与普通溶液有很大的不同。而 Carvalho等人研究了在 AOT 体系 中角质酶 (cuti-Base)的反酯化催化的动力学则表明，氢离子浓度低于 400-450mM时， 反应速度不遵循米氏方程，这可能与扩散有关。由于界面性质，分子质量的改变以 及各因素之间的相互依存的关系对动力学的影响还不是很清楚，因而增加了研究的 难度。所以目前尚不能完全从理论上对过程的传质速率等进行预测。 2.4.3 平衡模型 [20] 根据反胶团萃取机理和萃取过程特性，做如下假设： (1)蛋白质与盐离子均不溶于有机溶剂，表面活性剂存在于有机相中反胶团的界面 处； (2)反胶团微水相与主体水相性质相同； (3)蛋白质的存在对盐离子的分配平衡没有显著影响，可以忽略； (4)反胶团浓度足够大，蛋白质分配平衡呈线性 (分配系数为常数 ) ，一个反胶团至多 包含一个蛋白质分子。 目前所见的萃取热力学模型多采用上述假设，因为这些假设基本与实际过程相 符，并且利用这些假设既可简化模型的处理过程， 同时对计算结果不产生明显影响。 若蛋白质分子从水相转移到反胶团相所需能量为 χ ，则平衡时的分配系数为 根据假设 (2)，蛋白质在主体水相和反胶团微水相中的能量相同，故 代表蛋白 质在水相和有机相中与反胶团之间相互作用能的差．又由于水相不含反胶团，故 χ 即为有机相中蛋白质与反胶团之间相互作用能．当该相互作用能为零时，式 (1)简化 为如下形式 此时蛋白质的相转移只是熵增效应的结果。反胶团与蛋白质的相互作用包括静 现 代 分 离 科 学 8 2010 VOL 27 ： 467-479 电作用和疏水性作用，所以 以下对静电相互作用能 和疏水性相互作用能 χe 和疏水性相互作用 χh 分别加 以阐述。 e （一）静电相互作用能 χ 为了表达静电相互作用能，需引入 Stern紧密双电层理论。由于 AOT 的存在，反 胶团内界面带有负电荷， 热力学电势为 ψ0 。水溶液中的异电离子受到带电界面静电 力、van der Waals力及其他形式的吸引力作用，从而吸附在此界面上．吸附离子后， 反胶团内界面的电势为 ψs ，称为 Stern电势。由于异电离子所带电荷部分抵消了反 胶团内界面上的电荷， 使电势在 Stem层内急剧下降， 故在数值上小于 ψ0 。因为AOT 不溶解在水溶液中，所以主体水相中的电势为零，两相的电势差即为 ψs 。根据静 电学理论，有下式 0 ，Stern层内电荷密 Stern双电层中存在 3个电荷密度：反胶团内界面电荷密度 δ 1 度 δ和扩散层内电荷密度 δ2 。根据电中性原理 将这 3个电荷密度的表达式代人式 (6)，得到 s s 利用式 (7)可计算电势 ψ ，将 ψ 代人式 (5) 中则可计算静电相互作用能及其对蛋 白质分配平衡的贡献。 （二）疏水性相互作用能 在pH值等于蛋白质等电点的溶液中，蛋白质的净电荷数为零，静电相互作用能 现 代 分 离 科 学 9 2010 VOL 27 ： 467-479 e为零，根据式 (4)，有 χ 借鉴双水相萃取研究中描述疏水性相互作用的方法，疏水性相互作用能可用下 式表示 混合反胶团中包含 AOT 和PNE4两种表面活性剂，它们的疏水性因子不同。 因此， 反胶团的疏水性因子 HF表示为 将式 (9)和式 (10)代人式 (8)，得 式(11)即为疏水性相互作用能模型．将式 (5)和式 (11)代人式 (4)得到蛋白质分配 平衡模型方程 该分配平衡模型中，各疏水性因子 HFAOT ， HFpNE4和 ΔHFS以及吸附能 Φ[ 式(7)] 需实验确定。其他模型参数可从文献中获得 (表 1)。． 现 代 分 离 科 学 10 2010 VOL 27 ： 467-479 2.5 开发与应用 由于反胶团具有优良的特性，其在食品工业，药物，农业化学等领域的应用得 到了大量的研究和开发，并显示了巨大的应用潜力。其最早被应用于蛋白质萃取。 目前应用此技术处理的蛋白质或其混合物包括仅 α-淀粉酶、细胞色素 c、核糖核酸 酶、溶菌酶、 α-胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、过氧化氢酶等。 现阶段，关于反胶团的应用研究层出不穷。 Alexander等人研究了亲水性花青染料 顺-反异构体在反胶团体系中的光谱特性； Johnston等人利用超临界 CO2 体系中的反 胶团成功进行了分子量为 67000的牛血清白蛋白的萃取。 同时，由于反胶团微乳液的 液滴直径小 (5-200nm)，液滴分散性好， 用反胶团微乳液合成纳米粒子具有广泛的应 用前景。 Lepiller 采用硅氧烷表面活性剂，聚合甲基丙烯酸甲酯，成功的得到高分子 量、尺寸分布窄的微纳米级球状高聚物颗粒。反胶团酶膜反应器，能够实现产物的 浓缩、分离，且不用补充助表面活性剂和水，应用酶膜反应器，能够水解橄榄油、 卵磷脂、生产 L一色氨酸、降解农药并有望实现连续生产。但是，反胶团界面的复 杂性，表面活性剂的自聚性等都成为制约其发展的因素。今后，如何实现产物渗透 和底物截留以及膜反应器连续操作的动力学研究都有待进一步的研究。 目前，反胶团技术大多还处于实验室阶段，它们的微结构与蛋白质萃取的选择 性之间的规律、蛋白质与表面活性剂的相互作用、萃取机理等尚需进一步的探讨； 如何萃取分子量大的蛋白质，如何最大限度的保持蛋白质的活性，也是值得研究的 课题；同时反胶团技术在制备纳米粒子，模拟酶膜反应器以及用作生物探针等诸多 方面都显示了强大的优势，但都需要在理论和实践方面多加探讨。可以相信，随着 研究的不断深入，利用反胶团萃取技术对蛋白质等生物产品进行大规模的分离和纯 化已为时不远。 现 代 分 离 科 学 11 2010 VOL 27 ： 467-479 3. 参考文献 [1] 徐宝财，王媛等，反胶团萃取分离技术研究进展， 日用化学工业，2004，34 （6 ）： 390-393 [2] 沈忠耀 ,表面活性剂在生物工程中的应用之一 -反胶团萃取 , 日用化学工业， 2001，1:24-27 [3] B A Andrews ，D L Pyle and J A Asenjo．The effect of pH and ionic strength on the partitioning of four proteins in reversed micelles system[J]．Biotech and Bioeng，1994， (43)：1052-1058． [4] Somunk Jarudilokkul ，et o1．Selective reverse micelles extraction of three proteins from filtered ferm entation broth using response surface methodology[J]．Sep Sci and Tech，2000，(35)：503-517 [5] C Regalado，J A Asenio，and D L Pyle．Studies on the purification of peroxidase from horseradish roots using reverse micelles,Enzyme 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