第六章双水相萃取回顾聚合物不相溶性1977年，瑞士的Luisi等人首次提出用反胶团萃取蛋白质，但并未引起人们的广泛注意。直到80年代，生物学家们才开始认识到其重要性，荷兰的Van‘tRiet和Dekker、美国的Gokelen和Hatton首先进行了反胶团萃取蛋白质的研究。概述近年来该项研究已在国内外深入展开。从所得结果来看，反胶团萃取具有成本低、溶剂可反复使用、萃取率和反萃取率都很高等突出的优点。此外，反胶团萃取有可能解决外源蛋白的降解，即蛋白质(胞内酶)在非细胞环境中迅速失活的问题，而且由于构成反胶团的表面活性剂往往具有溶解细胞的能力，因此可用于直接从整细胞中提取蛋白质和酶。定义：反胶团(ReversedMicelles)是两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成的，内含微小水滴的，空间尺度仅为纳米级的集合型胶体。是一种自我组织和排列而成的，并具热力学稳定的有序构造。（1）表面活性剂阴离子型：AOT(AerosolOT，学名丁二酸-2-乙基已基酯磺酸钠或琥珀酸二（2－乙基己基）酯磺酸钠，p154)，优点:CTAB(cetyl-methyl-ammoniumbromide)溴化十六烷基三甲铵DDAB(didodecyldimethylammoniumbromide)溴化十二烷基二甲铵TOMAC(triomethyl-ammoniumchloride)氯化三辛基甲铵将阳离子表面活性剂如CTAB溶于有机溶剂形成反胶团时，与AOT不同，还需加入一定量的助溶剂(助表面活性剂。这是因为它们在结构上的差异造成非离子型：TritonX、Brij60常用的表面活性剂及相应的有机溶剂（2）临界胶团浓度(CriticalMicelleConcentration，CMC)临界胶团浓度,是胶团形成时所需表面活性剂的最低浓度，用CMC来表示，这是体系特性，与表面活性剂的化学结构、溶剂、温度和压力等因素有关.CMC的数值可通过测定各种物理性质的突变(如表面张力、渗透压等)来确定。大多数非极性溶剂中CMC都在0.1-1.0mmol/L范围内。由于构成反胶团的表面活性剂往往具有细胞破壁功效，因而可直接从完整细胞中提取具有活性的蛋白质和酶;将表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶团浓度(CMC)时，表面活性剂就会在水溶液中聚集在一起而形成聚集体，在通常情况下，这种聚集体是水溶液中的胶团，称为正常胶团(normalmicelle)。若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶团浓度(CMC)，便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体称为反胶团，在反胶团中，表面活性剂的非极性基团在外与非极性的有机溶剂接触，而极性基团则排列在内形成一个极性核(polarcore)。此极性核具有溶解极性物质的能力，极性核溶解水后，就形成了“水池”(waterpool)。当含有此种反胶团的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质及其他亲水物质能够通过螯合作用进入此“水池”。由于周围水层和极性基团的保护，保持了蛋白质的天然构型，不会造成失活。用于萃取蛋白质等生化物质的胶团是反胶团，反胶团的形状通常为球形，也有人认为是椭球形或棒形;反胶团的半径一般为10～100nm，可由理论模型推算，计算公式如下：αsurfNρ6W为每个反胶团中水分子与表面活性剂分子数的比值，假定表面活性剂全用于形成反胶团并忽略有机溶液中的游离水，则W等于反胶团溶液中水与表面活性剂的摩尔浓度比值，称为含水率（watercontent）M，ρ分别为水的相对分子质量和密度surf为每个表面活性剂分子在反胶团表面的面积，它与表面活性剂、水相和有机溶剂的特性有关，对离子型来说，室温下为0.5-0.7nm从式可知，Rm与Wo成正比，因此可通过测定与水相平衡的反胶团相所增溶的水量来判定反胶团尺寸的大小和每个反胶团中表面活性剂的分子数。较低时，反胶团水池内水的理化性质与正常水相差悬殊。例如，以AOT为表面活性剂，当W＜6-8时，反胶团内微水相的水分子受表面活性剂亲水基团的强烈束缚，表观粘度上升50倍，疏水性也极高。随W＞16时，微水相的水与正常的水接近，反胶团内可形成双电层。但即使当W值很大时，水池内水的理化性质也不能与正常的水完全相同，特别是在接近表面活性剂亲水头的区域内。关于反胶团溶解蛋白质的形式，有人提出了四种模型：水壳模型水壳模型的正确性（亲水性蛋白质）值密切相关，说明酶对其周围存在的水层非常敏感；(2)反胶团内酶反应动力学行为与在正常的水相中相似，活性与pH的关系同样表现为钟状曲线）水相pH值对萃取的影响只有当反胶团内表面电荷，也就是表面活性剂极性基团所带的电荷与蛋白质表面电荷相反时，两者产生静电引力，蛋白质才有可能进入反故对于阳离子表面活性剂、溶液的pH值需高于蛋白质的pI值，反胶团萃取才能进行；对于阴离子表面活性剂，当pH＞pI时，萃取率几乎为零，当pH＜pI时，萃取率急剧提高，这表明蛋白质所带的净电荷与表面活性剂极性头所带电荷符号相反，两者的静电作用对萃取蛋白质有利，如果pH值很低，在界面上会产生白色絮凝物，并且萃取率也降低．这种情况可认为是蛋白质变性之故。对不同相对分子质量的蛋白质，pH值对萃取率的影响有差异性对不同相对分子质量的蛋白质，pH值对萃取率的影响有差异性，当蛋白质相对分子质量增加时，只有增大(pH-PI)值的绝对值，相转移才能顺利完成，如α-糜蛋白酶(相对分子质量为25000)的萃取率在pH值低于pI值2-4时达到最高，而牛血清蛋白(相对分子质量为68000)在相同的系统中根本不发生相转移。对于包含大蛋白分子的反胶团，其尺寸远大于“空核”的反胶团，萃取时势必要消耗较多的能量，这些能量只能通过较强的静电相互作用得到补偿。用调节pH的作用来增加蛋白质分子表面电荷的方法，正是达到增强静电作用的一条途径。（2）离子强度对萃取率的影响离子强度对萃取率的影响主要是由离子对表面电荷的屏蔽作用所决定的：a.离子强度增大后，反胶团内表面的双电层变薄，减弱了蛋白质与反胶团内表面之间的静电吸引，从而减少蛋白质的溶解度；b.反胶团内表面的双电层变薄后，也减弱了表面活性剂极性基团之间的斥力，使反胶团变小，从而使蛋白质不能进入其中；c.离子强度增加时，增大了离子向反胶团内“水池”的迁移并取代其中蛋白质的倾向，使蛋白质从反胶团内被盐析出来；d.盐与蛋白质或表面活性剂的相互作用，可以改变溶解性能，盐的浓度越高，其影响就越大。如离子强度(KCl浓度)萃取核糖酸酶a,细胞色素c和溶菌酶的影响,在较低的KCl浓度下，蛋白质几乎全部被萃取，当KCl浓度高于一定值时,萃取率就开始下降，直至几乎为零。当然，不同蛋白质开始下降时的KCl浓度是不同的。（2）离子强度对萃取率的影响（3）表面活性剂类型的影响应从反胶团萃取蛋白质的机理出发，选用有利于增强蛋白质表面电荷与反胶团内表面电荷间的静电作用和增加反胶团大小的表面活性剂， 除此以外，还应考虑形成反胶团及使反胶团变大(由于蛋白质的进入)所需的能量的大小、反胶团 内表面的电荷密度等因素，这些都会对萃取产生 影响。 目前研究中常用的AOT反胶团体系和其他体系有许多不足，如不能用于分子量较大的蛋白质 的萃取和往往在两相界面上形成不溶性的膜状 物等等，为克服这些不足,可通过在单一表面活 性剂中加入具有亲和作用的生物表面活性剂或另 一种非离子型表面活性剂的方法来改善萃取性能。 （3）表面活性剂类型的影响 （4）表面活性剂浓度的影响 增大表面活性剂的浓度可增加反胶团的数量，从而增大对蛋白质的溶解能力。 但表面活性剂浓度过高时，有可能在溶液中形成比较复杂的聚集体，同时会增加反萃取过程 的难度。 因此，应选择蛋白质萃取率最大时的表面活性剂浓度为最佳浓度。 （5）离子种类对萃取的影响 阳离子的种类对萃取率的影响主要体现在改变反胶团内表面的电荷密度上。 通常反胶团中表面活性剂的极性基团不是完全电离的，有很大一部分阳离子仍在胶团的内表面上(相反离子缔合)。 极性基团的电离程度愈大，反胶团内表面的电荷密度愈 大，产生的反胶团也愈大。 （6）影响反胶团结构的其他因素 （a）有机溶剂的影响: 有机溶剂的种类影响反胶团的大小，从而影响水 增溶的能力，所以可以利用因溶剂作用引起的不同胶团结构实现选择 性增溶生物分子的目的，如α-胰凝乳蛋白酶随溶剂的不同在反胶团中 增溶的比率会出现显著的差别。 （b）助表面活性剂的影响: 当使用阳离子表面活性剂时，引入助表面活 性剂，能够增进有机相的溶解容量，这多半是由于胶团尺寸增加而产 （c）温度的影响:温度的变化对反胶团系统中的物理化学性质有激烈的 影响，增加温度能够增加蛋白质在有机相的溶解度，例如增加温度可 使α-胰凝乳蛋白酶进入NH -氯仿相并在转移率上分别增加50％。反萃取和蛋白质变性 对于反萃取条件，一般根据蛋白质正向萃取的特性来考虑，即选择正向萃取率最低时的pH值、离子种类和浓度作为反萃取的条件. 一些新的方法：如使用硅石从反胶团中反萃取出蛋白质;或采用笼形水合物的形成，使反胶团中的蛋白质沉淀析出.即用高压气体与反胶团溶 剂接触.使气体溶于溶剂中，降低溶剂相的密度，这时，反胶团“水池” 中的水转变为笼形水合物而沉淀析出;或通过改变温度，使原先增溶在 反胶团中的水成为一过量水相，分离出此水相后就可回收大部分的蛋 白质等。 有关萃取和反萃取过程的微观变化，可用分析萃取前后的α-螺旋分率来评估, 如α-螺旋分率变化很小，蛋白质活性稳定。 在生化物质提取方面，反胶团溶液能否作为萃取剂，要看它们是否可以从实际发酵液中选择性地萃取目标蛋白质。 的AOT/异辛烷反胶团溶液从芽抱杆菌的全发酵液中提取和纯化碱性蛋白酶 （Mr=33000），通过优化过程参数，相对比活力可高达 6，三级错流操作时，酶的提取收率为50%。 这一事实有力地证明了利用反胶团萃取处理全发酵液的可行性，同时表明采用这一技术可使纯化和浓缩一步完成。 如用CTAB/己醇－辛烷(1：9，V/V)体系反胶团溶液从棕色固氮菌细胞悬浮液中提取、纯化胞内脱氢酶。菌体细胞在表面活 性剂的作用下破裂。析出的胞内酶随即进人反胶团的水池中， 再通过加入合适的溶液改变环境，酶又能被反萃取，进入水溶 缺陷：（1）而对相对分子质量较大的如葡萄糖－6－磷酸脱氢酶 (Mr=200000)，不能提取有活性的酶。 （2）细胞碎片会留在反胶团中。 反胶团萃取的一个非常吸引人的应用是使蛋白质复性。重组DNA技术生产的大部分蛋白质，须溶于强变性剂中，使它们从 细胞中抽提出来。除去变性剂，进行复性的过程通常要在非常 稀的溶液下操作，以避免部分复性中间体的凝聚。 有人用AOT/异辛烷反胶团溶液萃取变性的核糖核酸酶，将负载有机相连续与水接触除去变性剂盐酸胍，再用谷胱甘肽的混 合物重新氧化二硫键，使酶的活性完全恢复，最后由反萃液回

　　2012高中物理精品课件31《匀变速直线运动的规律》鲁科版必修1