掌叶覆盆子（灌木），属于蔷薇科，是一种多年生落叶灌木，广泛种植于中国东部和东南部，特别是江西、浙江、江苏、安徽、福建。成熟的红色水果可以作为新鲜水果食用，也可以用来生产果酱、果汁和罐头食品等等。绿色未成熟的果实，即青果覆盆子（FPZ），FPZ提取物或有效成分具有多种生物活性，黄酮类、酚酸类、鞣花单宁类、挥发油类和萜类化合物是产生上述保健功效的主要化学成分，尤其是黄酮类和鞣花单宁类。

　　糖尿病、痛风、色素沉着和阿尔茨海默病是发达国家和发展中国家广泛发生的众所周知的慢性疾病，已成为全球的健康问题，对人类生活造成了严重的不良影响。有一些关键酶参与了这些疾病的发生发展，如α-葡萄糖苷酶、黄嘌呤氧化酶、酪氨酸酶、丁酰胆碱酯酶和乙酰胆碱酯酶。抑制这些酶的活性可以影响这些酶参与的导致这些疾病进展的机制。然而，许多临床酶抑制剂，如阿卡波糖、别嘌呤醇、曲酸和加兰他敏，表现出不良的胃肠道问题和毒性作用。因此，从天然来源寻找抑制剂是其低毒性的一个很好的选择。

　　植物材料中活性成分的回收效率较大程度上取决于提取方法，不同材料的最佳提取方法因材料性质和化学成分的不同而不同。开发一种从特定材料中提取活性成分的有效方法是很重要的。FPZ是一种广受欢迎的中药，具有多种药理活性，但目前尚无研究分析不同极性的溶剂对FPZ提取物的降糖、抗痛风、抗阿尔茨海默病和皮肤美白能力的影响。活性成分的提取和富集方法也尚未研究。

　　目前研究的目的是评估FPZ在减轻高血糖、痛风、阿尔茨海默病和色素沉着方面的潜力，并获得适当的提取和富集方法。以不同浓度的乙醇和甲醇（20%、40%、60%、80%和100%）为溶剂，分别采用超声辅助提取和浸渍法提取生物活性成分。通过α-葡萄糖苷酶、黄嘌呤氧化酶、乙酰胆碱酯酶和酪氨酸酶抑制能力测定酚类和黄酮的得率和提取效率，评价提取物的降糖、抗痛风、抗阿尔茨海默病和皮肤美白活性潜力。将生物活性最高的样品经大孔树脂分离得到富集组分，采用高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱( HPLC-QTOF-MS / MS法)对其进行化学表征，并通过C57BL/6小鼠评价其体内餐后降血糖活性。

　　在本研究中，我们选择不同浓度的乙醇和甲醇水溶液作为提取溶剂，因为水-有机混合溶剂通常比绝对有机溶剂更有效地从植物材料中回收多酚，并且与丙酮、乙酸乙酯、氯仿和正己烷相比，它们更环保。

　　由表1可知，干提取物得率在8.10%~23.00%之间变化，当乙醇和甲醇浓度大于60%时，该值随乙醇和甲醇浓度的增加而降低。20EUS和40EUS的产率最高，分别为23.00%和22.60% (P 0.05)，是100%乙醇提取物最低产率的2.5~2.8倍。通过20%~40%溶剂比80%~100%溶剂的产量更好，可能强极性溶剂促进细胞组织的肿胀和渗透性，导致更好的分子扩散，回收更多的高极性物质，如酚酸、糖和蛋白质。此外，除100%乙醇、20%和40%甲醇提取物外，超声辅助提取物的回收效果优于浸渍（P 0.05）。

　　注：a-g同一列中的不同字母表示用样品法制备的样品之间存在显著性差异（P 0.05）。*表示超声提取液与浸渍液的结果有显著性差异（P 为0.05，提取溶剂相同）。

　　不同溶剂和方法制备的提取物中酚类和黄酮类化合物的含量见表1，说明萃取溶剂和方法对酚类和黄酮类化合物的回收率都有很大的影响。40EUS和80MMT的总酚含量最高，分别为146.57和144.88 mg GAE/g（P 0.05），其次为60EUS（139.77 mg GAE/g）。而100EMT和100EUS中总黄酮含量最高（25.72~26.95 mg Que/g，P 0.05），20 MMT（20%甲醇溶液浸提）中总黄酮含量最低（7.68 mg Que/g）。在浸渍情况下，黄酮的含量随着乙醇和甲醇浓度的提高而增加。这表明FPZ中存在的黄酮类化合物更易溶于高浓度的乙醇/甲醇，而酚类化合物易溶于中极性溶剂( 40%、60%、80%)。因此，综上所述，以40%乙醇为溶剂的超声辅助提取是回收FPZ中酚类和黄酮类化合物的合适方案。

　　α-葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶的抑制剂分别被认为是治疗高血糖、阿尔茨海默病、色素沉着和低尿酸血症的有效策略。这4种酶也是被广泛用于筛选抗相关疾病药物的最常见的靶点。

　　FPZ提取物对α-葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶的抑制作用见图1。所有提取物对供试酶均有抑制能力，其中对α-葡萄糖苷酶的抑制能力最强 IC50值范围为0.08~1.49 μg/mL，远低于阳性对照阿卡波糖( 70.20 μg/mL ) (图1A )，表明FPZ提取物具有良好的α -葡萄糖苷酶抑制活性。对于20%~80%乙醇和甲醇制备的样品，超声提取物总是比相应的浸渍提取物表现出更好的α-葡萄糖苷酶抑制作用。结合提取率(表1 )，40%乙醇结合超声提取被认为适合从FPZ中提取α-葡萄糖苷酶抑制剂。

　　如图1b所示，在不同溶剂和方法制备的样品中，对乙酰胆碱酯酶的抑制作用存在显著差异。超声辅助80%甲醇提取物（80 MUS）和超声辅助100%甲醇提取物（100 MUS）对乙酰胆碱酯酶的抑制能力最强，IC50值最低，为44.22~47.86 μg/mL，但远高于其阳性对照加兰他敏( IC50 = 0.19 μg/mL)。

　　图1 提取溶剂和方法对FPZ提取物抑制(A) α -葡萄糖苷酶、(B)乙酰胆碱酯酶、(C)酪氨酸酶和(D)黄嘌呤氧化酶的影响。

　　图1C显示IC50值随着乙醇或甲醇浓度的增加而降低，100EMT（100%乙醇溶液浸提）的IC50值最低IC50为17.23 μg/mL，表明FPZ提取物对酪氨酸酶的抑制作用比阳性对照曲酸(IC50值为2.26 μg/mL)略高。以上数据表明，对不同生物活性成分的最佳提取方法差异较大。

　　由于40EUS在供试样品中提取率最高，且α-葡萄糖苷酶抑制活性最强，因此选择40EUS进行进一步分离和α-葡萄糖苷酶抑制活性评价。经AB - 8大孔树脂分离，得到6 个洗脱组分，分别为水(156.19 g)、10% (17.87 g)、40% (67.97 g)、60% (39 g)、80% (4.05 g)和95 %乙醇(1.3 g)，其α-葡萄糖苷酶抑制能力见图2。

　　图2 40EUS及其组分的α-葡萄糖苷酶抑制能力。柱上方不同字母表示数据间差异显著( P 0.05)

　　由于α-葡萄糖苷酶抑制作用最强，作者选择40EUS的40%乙醇部分进行进一步的植物化学鉴定，负离子模式下记录的基峰色谱如图3所示。鉴定或初步鉴定了26个化合物，包括11个鞣花单宁、4个没食子单宁、7个酚酸和4个黄酮类化合物。表2总结了用于结构鉴定的质谱信息，包括保留时间、精确前体离子、分子式、碎片离子、拟命名和参考文献。

　　表2 通过HPLC-QTOF-MS/MS在负离子模式下获得40EUS的40%馏分中主要化合物的保留时间(RT)、前体离子、分子式、碎片离子、命名和参考文献

　　为确定40EUS的40%乙醇洗脱组分的体内餐后低血糖活性，采用C57BL/6小鼠进行动物实验。如图4所示。灌胃7天后，FPZ分数治疗组空腹血糖（FBG）水平显著降低（P 0.05），FPZ-L和FPZ-H组分别为4.47和4.43 mmol/L，远低于对照组（7.32 mmol/L）和阿卡波糖组（6.47 mmol/L）。本研究中检测到的对FBG水平的缓解效果明显好于Xie等人的报道的以0.5、1.0、2.0 g提取物/(kg .day)低、中、高剂量灌胃小鼠，治疗4周后FBG水平仅分别下降10.7%、20.2%、19.8%。而本研究中给药剂量为30和60 mg/(kg·d)，说明提取优化和富集降糖成分的效果较好。糖负荷30 min后，对照组、FPZ-L组、FPZ-H组、阿卡波糖组的餐后血糖分别为9.95、6.7、6.3、8.1 mmol/L，且FPZ-H和阿卡波糖的曲线 mmol/L，FPZ-L组也显著低于对照组和阿卡波糖组(图4B )，表明40%乙醇洗脱部位改善口服糖耐量的效果优于阿卡波糖(5 mg/kg )。因此，40EUS的40%乙醇洗脱部分通过抑制α-葡萄糖苷酶对FBG有良好的改善作用，并可提高口服葡萄糖耐量。可水解单宁，特别是鞣花单宁可能是主要的贡献者，因为它们被检测到为主要的化合物（表2）。此外，水解单宁已被报道是许多植物的主要抗糖尿病成分。

　　图4 FPZ 40%乙醇洗脱部位对C57BL/6小鼠口服葡萄糖耐量试验血糖水平的影响。(A)葡萄糖含量，(B)餐后葡萄糖含量的曲线下面积(AUC)。FPZ-H、FPZ-L、阿卡波糖组与对照组比较，*表示对照组与FPZ/FPZ-H/阿卡波糖组比较，差异有统计学意义。

　　本研究首次比较了通过不同方法和溶剂回收的FPZ提取物的代谢酶抑制活性。生物活性成分的产率和提取物的生物活性在很大程度上取决于萃取溶剂和所用的方法。40%乙醇超声辅助提取是回收FPZ中酚类物质的合适方法，而80%甲醇超声辅助提取更适合回收黄酮类化合物。用40%~100%甲醇和乙醇提取的样品对α-葡萄糖苷酶的抑制作用良好，对酪氨酸酶和黄嘌呤氧化酶的抑制作用较强，对乙酰胆碱酯酶的抑制作用较弱。其中40EUS、100EMT、80EMT和80MUS活性最强，IC 50 分别为0.08、17.23、71.85和44.22 μg/mL。低极性溶剂对乙酰胆碱酯酶和酪氨酸酶抑制剂的提取效果较好，超声对α-葡萄糖苷酶抑制剂的回收效果较浸渍好。40EUS的40%乙醇洗脱部位具有良好的体内外降血糖活性，且活性远高于临床降糖药阿卡波糖。从洗脱部分鉴定或初步鉴定出26 种化合物，其中15 种鞣花单宁、7 种酚酸和4 种黄酮，水解单宁是主要的降糖成分。总的来说，40EUS的40%乙醇洗脱部分有望通过降低餐后血糖水平来预防和治疗糖尿病。但初步鉴定的化合物的精确结构和α-葡萄糖苷酶抑制活性以及其抑制行为和机制有待进一步研究。

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