液-液萃取是最常用的液体样品萃取技术之一。液-液萃取常涉及互不相溶的两相溶剂,利用待测物在两相中具有不同的分配系数而达到分离的目的。在液-液萃取操作过程中一相通常为水相,而另一相为有机溶剂。亲水性强的化合物进入极性的水相多,而疏水化合物将主要溶于有机溶剂中。萃取进入有机相的被测物经溶剂挥发容易回收,而提取进入水相中的被测物经常能够直接注入反相HPLC色谱柱中分析。图1概括了LLE分离所包含的步骤。

　　由于萃取为一平衡过程,效率有限,两相中仍存在数量可观的被测物。因此可利用包括改变pH值、离子对、配位作用等的化学平衡,以提高被测物的回收率,和/或消除干扰。

　　能斯特(Nernst)分配定律说明任何种类溶质在两不互溶的溶剂中都有分配,而且其在两相中的浓度比例维持恒定:

　　其中,KD为分配常数;Co为被测物在有机相中的浓度;Caq为被测物在水相中的浓度。这样被测物被萃取进有机相的分数为:

　　其中,Vo为有机相的体积;Vaq为水相的体积;Φ为两相体积的比值(Vo/Vaq)。许多液液萃取操作在分液漏斗中进行,每一相的体积一般都需几十或几百毫升。采用一步提取,由于相比值Φ必须保持在一实际范围内[如0.1Φ10见式(2)],KD对定量回收两相之一中的被测物必须足够大(例如KD10)。在大多数分液漏斗液液萃取操作中,定量回收率(99%)需要两步或多步萃取。对多步萃取,合并每步萃取得到的被测物的总分数E为:

　　其中,n为萃取次数。例如某被测物的KD=5,两相的体积相等(Φ=1),被测回收率99%,则需要分三步萃取。增大KD可以采用以下几种方法:

　　②如被测物是离子或可电离,通过抑制其离子化,可加大其在有机相中的溶解度,即增大KD;假如被测物可电离,也可在有机相中添加离子对试剂,被测物与其结合形成离子对被萃取进有机相;

　　③可在水相中加入一种惰性的中性盐(例如硫酸钠),用盐析法降低被测物在水相中的浓度。

　　表1列出了一些典型的萃取溶剂以及不适于用作萃取(与水混溶的)溶剂的示例。除考虑互溶性外,溶剂极性以及与被测物极性的关系是主要的选择标准,当萃取溶剂的极性与被测物匹配时,其KD值最大,一般需要选择K值最大的操作条件。

　　注:第一栏中的溶剂可与第二栏的任一溶剂相匹配;与水混溶的有机溶剂不可与水溶剂一起用于LLE。

　　如果被测物的KD不适宜,可能需另外的萃取方法提高回收率[见式(3)]。这种情况下,在原样品中重新加入不混溶的溶剂,提取剩余的溶质,最后合并所有的提取液。一般来说,最终提取溶剂的体积一定时,多次萃取比单次萃取的溶质回收率高。也可以用反提法进一步减少干扰物。例如,还是考虑上述有机酸被测物的提取。假如被测物首先在低pH值条件下萃取进入有机相,极性干扰物(如亲水中性物、质子化碱)被留在水相中。如果用高pH值的新的水缓冲液反提有机相,则离子化有机酸重新转移到水相中,而将非极性的干扰物留于有机相中。于是分两步提取不仅能除去碱性干扰物也能够除去中性干扰物,而一步提取仪能除去这两种干扰物中的一种,不能把两种全除去。

　　如果KD非常低或所需样品的体积很大,用多步提取定量回收被测物将不实用,萃取的次数太多,萃取液的总体积可能过大[见式(3)]。而且,萃取率低,达到平衡需较长的时间。此时可采用连续液-液萃取方法,新溶剂连续不断地循环通过样品水溶液,被测物连续从样品液中提出,直至所有的被测物都从样品中提取干净。这些提取过程可长时间地运行(12-24h);甚至KD很小时,也能达到定量萃取要求(回收率99%)。

　　在液-液萃取操作过程中经常会碰到样品发生乳化、被测物牢固地吸附于微粒上、被测物与大分子量的化合物结合(如药物与蛋白质)、两相彼此互溶等问题。针对这些问题,可采用下述方法来解决。

　　①对于发生乳化问题,如果不破乳,水相与有机相之间会出现清晰的界面,被测物回收率会受到很大影响,可以采取在水相中加盐、加热或冷却萃取容器、用玻璃棉塞滤过,用相分离滤纸滤过、加少量不同的有机溶剂或者离心的方法来解决。

　　②如样品中有微粒存在,被测物吸附在微粒上可导致回收率降低。这种情况下,滤过之后用强溶剂洗涤微粒以回收被吸附的被测物,并将洗液合并入LLE的被测物相中回收吸附被测物的强溶剂可能包括改变pH值、增加离子强度,或用极性更强的有机溶剂。

　　③处理生物样品时,在液-液萃取中能正常定量回收的化合物可能会与蛋白质结合,回收率下降。蛋白结合在测定体液中的药物与药物代谢物时尤其棘手。可以采用加入洗涤剂、有机溶剂、离液序列高的试剂或强酸,加水稀释,以结合更强的竞争试剂替代等方法破坏样品中蛋白与被测物的结合。

　　④在不互溶的溶剂之间有很小的溶解度,其中互溶的部分可改变两相的相对体积,因此可将各相用另一相预先饱和,以便了解含有被测物相的真实体积,准确、优化测定被测物的回收率。最简单的饱和手段是在分液漏斗中先不加入样品,使两相达到平衡,此时两相相互饱和,均可用于液液萃取。

　　另外对液-液萃取来说,有机溶剂消耗量大、环境污染较为严重。因而,液相微萃取应运而生,集萃取、净化、浓缩、预分离于一体,具有萃取效率高、消耗有机溶剂少、快速、灵敏的特点,采用这种萃取可以很方便地在容量瓶中进行。选择密度小于水的有机提取溶剂,以便使小体积的有机溶剂聚集在瓶颈处,方便倾出。对定量分析来说,应该使用内标,以对提取结果加以校正。