【专利摘要】本发明公开了一种建立了离子液体均相液液萃取?高效液相色谱法测定乳及乳制品中6种甾体激素的分析方法。通过一定浓度的加标回收率实验，优化了离子液体均相液液萃取的条件和高效液相色谱仪的条件。对影响萃取和样品制备条件的因素进行了优化，优化的最佳条件是：70μL离子液体1?己基?3?甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体作萃取剂，80μL离子液体1?己基?3?甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体作萃取剂，0.3593g/mL的NH4PF6为离子对试剂，萃取10s，离心5min，调节样品溶液的pH值为3.0～5.0，NaCl浓度为7％该方法简便、快速、环保，适合乳及乳制品中6种甾体激素的测定。

　　[0001] 本发明涉及离子液体均相液液萃取-高效液相色谱法测定乳及乳制品中留体激素 的分析方法。

　　[0002] 留体激素是一类亲脂性的、低分子量的、具有活性的化合物，已被广泛用于畜牧业 以达到促进乳畜生长和改善饲料转化效率的目的，导致乳及乳制品中激素残留问题。由于 激素残留可能会危害人体健康，如导致与内分泌相关的肿瘤、出生和生育缺陷;诱发生殖系 统癌变或白血病;还会对婴儿及青少年的生长发育造成影响，引发性早熟等。因此，欧盟和 中国禁止在动物性食品生产中使用激素。乳及乳制品作为大众日常膳食中的重要组成部 分，其激素残留问题成为人们关注的热点。留体激素通过血液输送、乳腺合成，并最终引入 到牛奶中。据报道，西方的饮食中约60%至80 %的雌激素来自于牛奶和乳制品。基于这些化 合物的重要性和危害性，建立一种快速、高效、灵敏的方法检测乳及乳制品中的激素残留至 关重要。

　　[0004] 离子液体作为一类新兴的绿色溶剂，具有蒸气压低、热稳定性好、结构可调节以及 对有机和无机物有良好溶解能力等独特的物理化学性质，可代替传统的有机溶剂，在化学 领域得到广泛应用离子液体均相液液萃取是一种新的微萃取方法，原理是将亲水性离子液 体加入样品溶液中，再加入离子对试剂，在样品溶液中均匀地生成疏水性离子液体，目标化 合物同时被萃取、富集到此新生成的疏水性离子液体相中，从而使目标物达到萃取、分离、 富集的效果。

　　[0005] 文献对激素的测定方法的报道主要有比色法、薄层色谱法(TLC)、免疫分析法、生 物测定法、气相色谱法(GC)、高液相色谱法(HPLC)、气相色谱法-质谱法(GC-MS)、气相色谱- 串联质谱法（GC-MS/MS)、高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS)、高效液相色谱-串联质谱法 (HPLC-MS/MS)等。比色法、薄层色谱法灵敏度比较低，难以满足现代分析中定量限的要求， 已逐渐被淘汰;免疫分析法一般只针对某一种激素成分的检测，有其局限性;生物测定法测 定过程复杂，也不利于大量的推广应用;气相色谱法法不能直接应用于激素的测定，因为激 素的沸点较高，需要进行衍生化后进气相色谱法测定，而且一般需要与质谱联用进行分析， 衍生化过程增加了实验步骤，操作比较复杂；高效液相色谱紫外检测法是实验室比较容易 实现的方法，适合分析沸点高或热稳定性差的物质，因而也适合激素的分离测定，但灵敏度 和选择性较HPLC-MS或HPLC-MS/MS较差一些，但HPLC-MS或HPLC-MS/MS也有其自身的劣势， 如仪器较为昂贵，维护费用较高且需要技术水平较高的操作者，而且实验中也存在基质效 应等。

　　[0006] 本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种离子液体均相液液萃 取-高效液相色谱法测定乳及乳制品中6种留体激素的分析方法。

　　[0009]标准储备液的配制：分别准确称取适量的激素标准品，用乙腈溶解并全部转移至 50.OOmL容量瓶中，用乙腈稀释并定容至刻度，分别配制成1000.00yg/mL标准储备液，于-18 °(：冷冻避光保存。

　　[0010] 混合标准中间液的配制：分别移取各标准储备液1.OOmL于50.OOmL容量瓶中，用乙 腈稀释并定容，配制成各被测物浓度均为20.0 Oyg/mL的混合标准中间液，于-4 °C冷藏避光 保存。

　　[0011]混合标准工作液的配制：使用时根据需要对混合标准中间液进行稀释，用乙腈稀 释成不同浓度的混合标准工作液，现用现配。

　　[0014]离子液体均相液液萃取的关键是选择合适的萃取剂和离子对试剂，一般而言，需 要水溶性较好的离子液体作为萃取剂，加入离子对试剂发生交换反应之后形成的离子液体 疏水性要好，且对目标物的萃取率要高。实验选择[C6M頂][BF4]作为萃取剂，NH4PF6作为离 子对试剂。也研究了 [C4MIM] [BF4]、[C8MM] [BF4]、[C6MIM]Br等离子液体作为萃取剂时， NH4PF6作为离子对试剂时的回收率，均不及[C6M頂][BF4]作为萃取剂的回收率。因此，最终 选择[C6M頂][BF4]和NH4PF6分别作为萃取剂和离子对试剂。

　　[0015] 固定离子对试剂NH4PF6的质量为0.35g时，分别考查了加入70yL、80yL、90yL、100y L、110yL、120yL[C6M頂][BF4]时6种甾体激素的回收率。[C6M頂][BF4]加入量为70yL时，6种 甾体激素的的峰面积相对较大，随着离子液体的增加，回收率逐渐下降。

　　[0017] 萃取时间不管是在什么形式的萃取中都是影响萃取效率的一个非常重要的因素。 萃取时间过短，目标物在两相中的分配可能不能达到平衡;萃取时间过长，又增加了时间成 本。但在离子液体均相液液萃取中，在疏水性离子液体[C6MHC [PF6]的形成过程中，目标物 在水溶液中与离子液体充分接触，因此，即便是萃取时间很短，目标物也很迅速地由水相分 配至离子液体相达到平衡，从而完成萃取过程。这也是离子液体均相液液萃取的一个特别 突出的优点。实验考查了涡旋震荡进行萃取的时间分别为1 〇 s、3 0 s、1.0 m i η、2.0 m i η、 3. Omin、5. Omin时6种甾体激素的回收率，结果表明，萃取时间为10s以后6种甾体激素的回 收率已经趋于稳定，因此最终选择涡旋震荡萃取时间为l〇s。

　　[0018] 离心是促进水相和离子液体相进行分离的过程。离心时间过短，离子液体相的分 离可能不够充分，目标化合物的回收率低;但离心时间过长，也增加了实验的时间。一般而 言，低温也有利于降低疏水性离子液体在水中的溶解度，有利于两相的分离。实验考查了-4 °〇条件下以 15 OOOr/min分别进行离心1 ·0min、3.0min、5·0min、8·Omin、10·Omin、15·Omin、 20 . Omin时6种甾体激素的回收率，结果表明，此条件下离心1. Omin、3. Omin、5. Omin时目标 物的回收率差别不大，但离心5. Omin以上回收率反而有所降低。因此，5. Omin的离心时间是 足够的。最终选择5. Omin作为最佳的离心时间。

　　[0019] 样品溶液的pH值在萃取过程中非常重要，因为pH值可影响目标物在溶液中的类 型，并且与回收率直接相关。考查了样品的pH值分别为1.0、3.0、5.0、6.0、7.0、8.0、10.0、 12.0、 14.0时的回收率，结果表明，pH值为5.0时，6种甾体激素的回收率最高。pH值为1.0、 3.0、 6.0时目标化合物的回收率也较高，也就是目标化合物在酸性条件下回收率均较好，但 碱性条件下回收率明显降低有的甚至没有回收。可能是由于这6种留体激素均为弱酸性化 合物，在弱酸条件下，目标物以分子的形式存在，容易与离子液体形成混合物。考虑到乳及 乳制品在酸性条件下去除蛋白效果较好，因此，最终选择样品溶液的pH值为3.0~5.0。

　　[0020] 20.0 OmL样品中盐浓度与离子强度相关，本实验用加入NaCl进行调节。一般而言， 随着NaCl的增加，离子强度增加，目标物和形成的疏水性离子液体在水溶液中的溶解度减 小，有利于回收率的增加，即盐析作用比较明显。但NaCl浓度过高时，C1-又会导致[C6MIM] [C1 ]的生成，从而影响疏水性离子液体[C6MIM] [PF6 ]的形成，从而影响回收率。实验考查了 NaCl(w/v)分别为 0.0%、1.0%、2.0%、3.0%、5.0%、7.0%和10.0%时6种甾体激素的回收 率，结果表明，NaCl盐浓度为1.0 %~7.0 %时6种甾体激素的回收率差别不大，均较高。因为 NaCl的加入有助于沉淀乳及乳制品中的蛋白质，因此，本实验实验最终选择NaCl浓度的浓 度为7.0%，考虑到5.OmL样品用15mL NaCl溶液提取后样品溶液浓度为7.0%，选择配制的 NaCl溶液浓度为100g/L。

　　[0021] 最佳条件是：70yL离子液体1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体（[C6MIM] [BF4])作萃取剂，80yL离子液体1-己基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体（[C6MM] [BF4]) 作萃取剂，0.3593g/mL的NH4PF6为离子对试剂，萃取10s，离心5min，调节样品溶液的pH值为 3.0~5.0，NaCl浓度为7 %。在此条件下，乳及乳制品中6种甾体激素的回收率为81~124%， 相对标准偏差为3.2~6.5%，定量限为1. Oyg/kg。

　　[0022] 本发明的有益效果:本方法利用离子液体均相液液萃取技术，建立了乳及乳制品 中6中留体激素的测定方法，利用液相色谱仪进行测定，操作简单，快速，且灵敏度高。该方 法简便、快速、环保，适合乳及乳制品中6种留体激素的测定。

　　[0024]以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用 于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

　　[0027]样品溶液的制备：取5.OOmL牛奶样品于50mL聚四氟乙烯的贝克曼离心管中，加入 lO.OOmL 100g/L的NaCl溶液和150yL的磷酸溶液，超声提取条件下以15 OOOr/ mi η离心15mi η，将上清液转移至另一支50mL聚四氟乙稀的贝克曼离心管中。再加入 5.00mL100g/L的NaCl溶液于残渣内，超声振提取2min，-4°C条件下以15 000r/min离心 15min。合并上清液过0.22μπι水相滤膜作为样品溶液。

　　[0028] 均相微萃取过程:用微量注射器加入70yL离子液体[C6M頂][BF4]于上述样品溶液 中，后涡旋振荡约l〇s，使二者充分混匀，使离子液体全部溶解后形成均一相的溶液。然后加 入1.00mL 0.3593g/mL的NH4PF6水溶液，涡旋振荡10s，充分混匀后在-4°c条件下以15 000r/min离心5.0min，新的疏水性离子液体形成并附着于离心管底部。去除上层水溶液后， 加入100此乙腈，混匀，置于进样瓶的内插管中，通过高效液相色谱仪进行分析。所有的条件 优化实验均重复两次。

　　[0029] 利用本方法对纯牛奶、脱脂牛奶、低脂牛奶、巴氏杀菌乳和超高温灭菌奶中6种甾 体激素进行了测定。结果表明，在实际样品分析中，本方法的回收率范围为65.6~115%。， 精密度RSD值范围为2.5~6.3 %。其中均检出孕酮，含量在1.2~3.8yg/kg之间。标准溶液的 谱图如图1。

　　[0030] 工作曲线 ]对纯牛奶制成的样品溶液进行加标，制备一系列加标浓度不同的加标样品，用所 建立的方法分析这些加标样品。以加标浓度(c)和峰面积(A)分别作为横坐标和纵坐标，绘 制工作曲线，利用液相色谱仪软件自动计算6种留体激素的线] 定量限（Limits of Quantification，LOQ)是当待测物的信号与噪音（S/N)为10时 对应的待测物的浓度。6种留体激素的定量限见表1。

　　[0035] 为了考查方法的精密度，通过对纯牛奶进行5.0、10.0和50.0 yg/kg这三个浓度的 加标回收实验，考查了 6种留体激素的日内精密度和日间精密度。日内精密度为一天之内不 同的时间对样品3个加标浓度分别进行5次实验（n = 5)，考查其回收率和相对标准偏差 (RSD)。日间精密度为连续5天(n = 5)，每天对样品进行3个加标浓度的实验，考查其回收率 和RSDA种甾体激素的日内精密度RSD值位于3.0~4.5%。日间精密度RSD值位于3.5~ 5.8%〇

　　[0036]最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可 以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的 保护范围之内。

　　【发明人】康明芹, 李玲, 杨璐, 胡婷婷, 曹海微, 田芳洁, 宋清莲, 顾婷婷

　　技术研发人员：康明芹;李玲;杨璐;胡婷婷;曹海微;田芳洁;宋清莲;顾婷婷;

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