1.本发明涉及生物分析技术领域，特别是涉及一种生物样品液液萃取前处理方法。

　　2.液液萃取是生物分析领域常用的样本前处理方法，适用于非极性至中等极性分析物的分析。该方法基于目标分析物在生物基质和萃取剂之间分配不同，通过生物样品和萃取剂混合震荡的操作，将目标分析物萃取至有机相(萃取剂)中，有机相再经吹干、复溶等步骤，得到提纯稀释后的分析物溶液，最后经液相质谱仪分析测定浓度数据。

　　3.目前行业内成熟的做法是将生物样品和萃取剂加入96深孔板中，先使用封板机对96深孔板密封，再进行涡旋振荡，离心，然后使用移液器(或液体工作站)转移上层有机相至另一96深孔板，再使用氮吹浓缩机对96深板内通入氮气流直至有机相被吹干，之后加入合适比例的混合溶液复溶，样本前处理即完成，最后放入液相质谱仪中分析。

　　4.在该方法中，确保96深孔板在涡旋振荡时能封板牢固是避免孔间污染的关键，关系到分析试验结果的成败。使用常规操作流程(硅胶垫直接封板)是无法实现牢固密封的，原因在于96深孔板内萃取剂在高速涡旋振荡过程中，温度升高，挥发量增加，导致孔内压力增大，压力超过临界值时(硅胶垫的塞子与96深孔板孔壁之间的静摩擦力)硅胶垫即被顶开，内容物泄露，使样本污染试验失败。为解决上述问题，该方法使用了封板机对96深孔板进行密封。在封板时，将硅胶垫替换成专用的热熔膜，封板机通过高温和加压的方式将热封膜热熔固定在深孔板上从而实现对96深孔板的牢固密封。

　　5.然而当前市场上封板机型号众多，不同型号的仪器密封效果不同，密封性能满足液液萃取试验要求的封板机通常依赖进口，价格昂贵。此外热封膜会对某些特定的分析物产生干扰，导致试验失败。这些因素都进一步限制了封板机的使用。

　　6.在没有封板机的条件下，传统的做法是以胶带缠绕的方式以人力对96深孔板进行胶封。或是将样本和有机试剂在离心管中进行涡旋混合，分层后再将有机相逐个转移至96深孔板中进行后续制备和分析。这两种方法都费时费力，且较为依赖实验人员的操作手法，自动化程度低。同时也有研究表明可以通过对样本和萃取剂“反复吸放”代替涡旋，但该方法必须依靠液体工作站才能实现，且液体工作站较封板机价格更为昂贵，极大增加了生物分析项目执行和实验室建设的成本。

　　7.基于此，有必要针对上述技术问题，提供一种易用高效的生物样品液液萃取前处理方法。

　　14.进一步的，所述96深孔板的孔的体积至少为2.0ml，每个孔内添加的样本体积不超过0.25ml。

　　19.使用多试管涡旋振荡器对96深孔板进行涡旋振荡，转速为2500rpm，时间为10～20min。

　　20.进一步的，所述真空包装机具备抽真空和真空密封功能，真空包装机密封后线.进一步的，所述真空包装机使用的真空包装袋材质为聚酰胺(pa)+聚乙烯(pe)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)+聚乙烯(pe)。线深孔板尺寸相匹配，包装袋长度不超过25厘米，宽度不超过20厘米。

　　22.上述生物样品液液萃取前处理方法，通过对真空包装机的创新应用，巧妙的解决了96深孔板在涡旋振荡过程中硅胶垫和96深孔板孔位难以保持紧密密封的问题。真空包装机能够自动抽出真空包装袋内的空气，达到预定真空度后完成封口工序，此时线深孔板产生强大的包裹力，硅胶垫被紧紧地压合在96深孔板上，经过测试密封效果极佳，可以满足高转速长时间涡旋振荡、低温高速离心等实验操作的要求。真空包装机价格便宜，保养和耗材的使用成本低，购货渠道广，工作效率高。上述技术方案，使液液萃取的前处理方法不再受封板机，液体工作站等价格昂贵的实验设备的限制，同时极大的节省人力，适应高通量生物样本分析的需求。

　　24.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

　　25.如图1所示，在一个实施例中，一种生物样品液液萃取前处理方法，包括以下步骤：

　　26.步骤s110，将生物样品和萃取剂加入96深孔板中。其中常用萃取剂有甲基叔丁基醚、乙酸乙酯、正己烷或是两种溶剂的混合。在加入有机溶剂之前还可以根据需要加入内标和缓冲溶液。内标的作用是帮助分析物定量。缓冲溶液用于调节基质ph，帮助分析物从水相萃取至有机相。内标和缓冲溶液和有机溶剂需要根据分析物的特性进行选择。

　　27.其中96深孔板有圆孔板和方孔板两种类型，圆孔板上每个孔之间的间距较大，孔壁厚，结构稳固不易变形，经过实测圆孔板密封效果好，方孔板则无法实现密封。同时要注

　　意每个孔内的内容物总体积不能超过1.5ml，这样涡旋振荡时才能产生稳定的涡流，从而保证每个孔内样本萃取率的一致性。通常萃取剂为样本体积的5倍即可保证有效萃取，此方法下每个孔内样本体积不可超过0.25ml。

　　28.步骤s120，使用线深孔板真空密封。将样本和有机溶剂加入96深孔板后，先用硅胶垫密封，再使用真空包装机进行抽真空密封，真空包装袋的大小需要尽量与96深孔板的尺寸相匹配，以方便后续涡旋和离心的操作。

　　29.经实测，具备抽真空和真空密封功能，线kpa以上的家用级真空包装机即可实现可靠的密封。单块96深孔板的真空密封在几十秒之内即可完成，速度与封板机相近，与手动胶封(封好一块板需要4分钟左右)相比，该方法极大地降低了时间和人力成本。

　　30.步骤s130，对密封好的96深孔板进行涡旋振荡和离心。密封好的96深孔板使用多试管涡旋振荡器进行涡旋振荡，转速为2500rpm，时间为10到20min(根据具体情况调整)，涡旋振荡结束后使用离心机离心，离心力3200g，时间为10分钟。

　　31.步骤s140，转移出96深孔板孔内上层有机相后进行后续样品处理和分析。离心结束后，可观察到孔内液体分为上下两层，使用移液器转移上层有机相至另一96深孔板进行后续样品处理和分析，转移前可以对96深孔板进行冷冻(放入干冰-乙醇浴或者-80摄氏度冰箱中)，冷冻处理后下层水相被冻结固定在底部，方便移液。需要说明的是，在条件允许的情况下，转移有机相的操作更推荐使用液体工作站完成。使用氮吹浓缩机向96深板内持续通入氮气流直至转移出的有机相被吹干，之后加入合适比例的混合溶液复溶。最后放入液相质谱仪中分析测定浓度数据。

　　32.上述生物样品液液萃取前处理方法，通过对真空包装机的创新应用，巧妙地解决了96深孔板在涡旋振荡过程中硅胶垫和96深孔板孔位难以保持紧密密封的问题，在满足高通量样本分析的同时，极大地降低了实验室建设成本。密封性能可靠的封板机售价通常在10万元人民币以上，价格较为昂贵，此外还需考虑设备维修、保养和耗材的使用成本，而家用真空包装机的价格通常在百元甚至百元以下，单个真空包装袋的成本也极低，且购买渠道广，市场备货充足，方便实验室快速建立匹配液液萃取方法的工作环境。从样本处理的效率看，该方法样本处理速度与使用封板机封板的方法相近，与传统的人力胶封和试管涡旋的方法相比，更适应高通量生物样本分析的需求，极大地节约了人力和工作时间。

　　33.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。