2.1活性成分提取方法 （1）溶剂提取法：提取（Extraction），或称抽提，是用溶剂（常称为浸取剂）使固体原料中的有效成分溶解并释放出来的过程。提取可分为有机溶剂提取(OrganicSolventExtraction)和水提取(WaterExtraction)。溶剂提取法 溶剂的选择：根据相似相溶原理，选择提取的溶剂。低极性化合物多选择亲脂性溶剂；高极性化合物多选择亲水性溶剂。溶剂提取法 常用有机溶剂的极性大小顺序：甲醇＞乙醇＞丙酮＞正丁醇＞乙酸乙酯＞＞氯仿＞苯＞环己烷＞石油醚。溶剂提取法 溶剂的选择：一般可将海洋生物按极性递增的方式，用不同的溶剂，如石油醚（可提取出叶绿素、油酯、游离甾体及三萜类化合物）、氯仿或乙酸乙酯（可提取出游离生物碱、有机酸等中等极性化合物）、丙醇或乙醇、甲醇（可提取出苷类、生物碱盐等极性化合物）及水（可提取氨基酸、糖等水溶性成分）依次进行提取。溶剂提取法 溶剂的选择：除了要考虑极性外，理想的有机溶剂还应具备下述条件：（1）溶剂不能与天然产物发生化学反应，特别是不可逆反应；（2）溶剂对目标活性物质溶解度大，对杂质溶解度尽可能小；（3）有机溶剂要来源广泛、经济、安全、毒性小等。溶剂提取法 温度的选择：（1）提取可以在室温下进行，也可以加热。一般来说，冷提杂质较少，而热提效率较高。（2）为了不影响活性成分的性质，提取液浓缩一般在60℃以下进行，尽可能采用减压浓缩的方式。水蒸气蒸馏法 水蒸气蒸馏法适用于能随水蒸气蒸馏而不被破坏的海洋生物药用成分的提取，主要为挥发油或者挥发性成分。这些化合物与水不相混溶成仅微溶，且在约100℃时有一定的蒸汽压，当水蒸气加热沸腾时，能将该物质一并随水蒸气带出。如挥发油类化合物。水蒸气蒸馏法 水蒸气蒸馏法 （1）取供试品适量（约相当于挥油0.5～1.0mL），称重（准确至0.01g），置烧瓶中，加水300~500mL（或适量）与玻璃珠数粒，振摇混匀后，连接挥发油测定器与回流管。（2）自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流入烧瓶时为止。水蒸气蒸馏法 （3）置电热套中或用其他适宜方法缓缓加热至沸，并保持微沸约5h，至测定器中油量不再增加，放置片刻，开启测定器下端的活塞，将水缓缓放出，至油层上端到达刻度0线h以上，再开启活塞使油层下降至基上端恰与刻度0线平齐，读取挥发油量，计算。水蒸气蒸馏法 挥发油（%，质量浓度）=V/W×100%     或挥发油（%，质量分数）=（V×D）/W×100%    式中V为测得挥发油体积，ml；     W为供试样的量，g；     D为挥发油的相对密度。溶剂萃取法 萃取（Extraction）是利用溶质在互相不能任意混溶的两相（如氯仿和水）之间分配系数的不同而使溶质得到分离的操作技术。萃取时如果各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高。溶剂萃取法 萃取操作中至少有一相为流体（液体或超临界流体），一般称该流体为萃取剂（Extractant）。以液体为萃取剂时，如果含有目标产物的原料也为液体，则称此操作为液－液萃取；如果含有目标产物的原料为固体，则称此操作为液－固萃取（亦称提取或浸取）。溶剂萃取法 （1）液－液萃取液－液萃取又称之为有机溶剂萃取或溶剂萃取。作为一项传统的分离技术，由于操作简单，无需特殊的仪器设备，因此，在分离纯化海洋天然小分子物质中发挥着极为重要作用。溶剂萃取法 （2）超临界流体萃取以超临界流体（SupercriticalFluid）为萃取剂的萃取技术称为超临界流体萃取（SupercriticalFluidExtraction，SFE）。溶剂萃取法 （2）超临界流体萃取超临界流体是指处于临界压力和临界温度以上状态的流体，此时物质既不是气体也不是液体的状态。临界温度是指该物质处于无论多么高的压力之下都不能被液化的最高温度，与之对应的压力称为临界压力，超临界流体操作过程中，含有目标产物的原料可以是液体，也可以是固体。溶剂萃取法 （2）超临界流体萃取超临界流体萃取分离过程的原理是利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。溶剂萃取法 （2）超临界流体萃取超临界流体最常用的萃取剂是CO2，主要有如下的性质：①无毒和不易燃性。CO2作为萃取剂，主要是它无毒、不易燃易爆，有较低的临界温度和临界压力，易于从混合物中分离出溶质。②有较低的临界温度和临界压力。CO2的临界温度为31.1℃，临界压力为7.3Mpa，CO2的临界条件比水更容易达到。溶剂萃取法 （2）超临界流体萃取③超临界流体的传递性质。超临界流体的密度接近于液体的密度，而黏度却接近于气体，自扩散能力比液体大100倍，与液体萃取相比，可以更快地完成传质，达到平衡，促进高效分离过程的实现。溶剂萃取法 （2）超临界流体萃取④超临界流体的溶解性。超临界流体的溶解度与密度有很大关系，在临界点附近，压力、温度的微小变化会引起流体密度的大幅度变化，从而影响其溶解能力。溶剂萃取法 （2）超临界流体萃取⑤超临界流体的萃取选择性。超临界流体应具有良好的选择性，根据相似相溶原理，如果超临界流体与萃取物质的化学性质越相似，溶解能力就越大。溶剂萃取法 （2）超临界流体萃取SFE－CO2特别适用于热敏性、易挥发、易氧化成分的分离，可实现对海洋天然小分子化合物的纯化与精制。如：海洋生物中n－3高度不饱和脂肪酸(HUFA)，特别是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，海洋生物毒素、萜类化合物、海洋天然色素、某些稀有氨基酸等。 （1）叶绿素叶绿素是陆生植物和海洋植物中普遍存在的绿色色素，一般不具有生物活性，能溶于一般有机溶剂，也难溶于水。2.2分离纯化方法 杂质处理方法杂质处理方法 （1）叶绿素生药用水提取时，水提液中叶绿素可以用苯或者氯仿抽提除去。如果是用酒精提取，酒精浓缩液加水，放置冰箱，叶绿素常可以沉淀出来。用70％左右的酒精提取时，回收酒精至浓缩液中含有15～20％左右时，放置冰箱，绝大部分叶绿素可沉淀出来。杂质处理方法 （2）油脂、蜡和树脂一般在提取之前，先用石油醚或苯提取，把这些物质除去。如果不预先处理，直接用酒精提取，提取液蒸去大部分酒精后用石油醚或苯抽提可除去油脂和蜡等。杂质处理方法 （3）无机盐少量无机盐一般不影响分离，有时水提取液中有大量无机盐。一般可将水提取液蒸干，加无水酒精或甲醇提取有机成分。如果有效成分溶于水，不溶于酒精就不能用这种方法。如果有效成分溶于乙酸乙酯、氯仿等则可用它们来萃取水液，无机盐留在水液中。杂质处理方法 （4）鞣质明胶沉淀法：样品水溶液加4％明胶水溶液，至沉淀完全，过滤，滤液减压液缩至小体积。加3～5倍酒精，使过量明胶沉淀；然后滤去沉淀。如果过量明胶尚未除尽，可将滤液浓缩后，再用酒精沉淀一次。也可以将加明胶沉淀后的混悬液，于水浴上热，不断搅拌，沉淀逐步凝结，将上清液倾出，减压浓缩，再按前述方法除去过量明胶。杂质处理方法 （4）鞣质生物碱沉淀法：常用的是咖啡因，其他生物碱及吡啶也可。样品水溶液加入1.5％咖啡因水溶液至沉淀完全，过虑，滤液用氯仿振摇，除去过量的咖啡因（注意水溶液中的其他活性成分是否被氯仿提出），即得除去鞣质的水溶液。沉淀中可回收咖啡因和鞣质。将沉淀置于空气中自然干燥或低温烘干，研磨后溶解于50～55％的热甲醇溶液中，用氯仿萃取。咖啡因进入氯仿层，鞣质里在稀甲醇溶液中。杂质处理方法 （4）鞣质醋酸铅沉淀法：试液中加入饱和醋酸铅水溶液至沉淀完全，鞣质被沉淀出。杂质处理方法（4）鞣质聚酰胺法：鞣质是一类多酚类物质，很容易吸附于锦纶柱上。低分子鞣质的吸附是可逆的，可采用适当的溶剂洗脱除去。高分子鞣质与锦纶的吸附是不可逆的，吸附后很难洗脱。无论什么样的鞣质，与锦纶的吸附比任何化合物都强，因此可以用锦纶除去。杂质处理方法 （4）鞣质氨水沉淀法：将含有鞣质的乙醇溶液，加氨水调节到合适的PH值至沉淀完全，过虑即可。2.3结晶和重结晶 结晶的目的在于进一步分离纯化，便于进行化学鉴定及结构测定工作。海洋植物中大多含有固体化合物，且具有结晶的通性，可以根据其溶解度的不同用结晶法来达到分离精制的目的。结晶和重结晶 一般能结晶的化合物可望得到单纯晶体，纯化合物的结晶有晶学特征，这有利于化合物性质的判断，所以结晶是研究分子结构的重要步骤。一般能结晶的大部分都是比较纯的化合物，但并不一定是单体化合物，有时结晶也是混合物。结晶和重结晶 （1）结晶的条件：浓度：需要结晶的溶液，往往呈过饱和状态。通常是在加温的情况下，使化合物溶解过滤除去不溶解杂质，浓缩、放冷、析出。有效成分在样品中的含量和浓度是影响结晶的一个重要因素。一般来说，含量越高越容易析出结晶，但是有时溶液太浓，粘度大反而不易结晶，如果浓度适中，逐渐降温，有可能析出纯度较高的结晶。结晶和重结晶（1）结晶的条件：溶剂：合适的溶剂，是影响结晶的另一个重要条件。有时有效成分在有关部位中含量即使很高，因溶剂选择不当，就得不到结晶；反而有时有效成分含量不是很高，但是选择溶剂恰当的时候就能够得到结晶。结晶和重结晶 （1）结晶的条件：温度及环境：结晶最合适的温度为5～10℃它左右，可放置于阴凉处或冰箱中。放置对形成结晶来说也是一个需要注意的方面，它可使溶剂自然挥发到适当的浓度即可析出结晶。结晶过程中尽量避免挪动结晶用的器皿，保证结晶过程不受外界干扰，在自然的情况下进行。结晶和重结晶 （2）结晶溶剂的选择：选择合适的溶剂是形成结晶的关键，最好它能对所需成分的溶解度随温度的不同而有显著的差别，同时不产生化学反应，即热时溶解，冷时则析出。对杂质来说，在该溶剂中应不溶或难溶。亦可采用对杂质溶解度大的溶剂而对欲分离物质不溶或难溶，则可用洗涤法除去杂质后再用合适溶剂结晶。结晶和重结晶（2）结晶溶剂的选择：一般游离的生物碱可溶于下列溶剂：苯、、氯仿、乙酸乙酯和丙酮。而盐类常不溶于苯、、乙酸乙酯；大多数能溶于乙醇、甲醇、水。甙类可溶于各种醇（甲醇……戊醇）、丙酮。乙酸乙酯、氯仿等；难溶于醚、苯。各类型的甙，由于甙元的不同，其溶解性差别很大。氨基酸在水中的溶解度很大，可考虑在甲醇或者乙醇中结晶。结晶和重结晶 （2）结晶溶剂的选择：另一方面也可进行少量探索，参考“相似物溶于相似物”的粗略规律加以考虑，如极性的羟基化合物易溶于甲醇、乙醇或水；多羟基化合物在水中比在甲醇中更易溶解；芳香族化合物易溶于苯和；杂环化合物可溶于醇，难溶于或石油醚；不易溶解于有机溶剂的化合物可用冰醋酸或吡啶。结晶和重结晶 （2）结晶溶剂的选择：常用的结晶溶剂有甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙醋等。但所选用的溶剂的沸点应低于化合物的熔点，以免受热分解变质。溶剂的沸点应低于结晶时的温度，以免混入溶剂的结晶。结晶和重结晶 （2）结晶溶剂的选择：不能选择适当的单一溶剂时可选用两种或两种以上溶剂组成的混合溶剂。要求低沸点溶剂对物质的溶解度大、高沸点溶剂对物质的溶解度小，这样在放置时，沸点低的溶剂较易挥发，而比例逐渐减少易达到过饱和状态，有利于结晶的形成。选择溶剂的沸点不宜太高，要适中约在60℃左右，沸点太低溶剂损耗大，亦难以控制；太高则不使浓缩，同时不易除去。结晶和重结晶 （3）重结晶溶剂的选择：重结晶用的溶剂一般可参照结晶的溶剂，但也经常改变，因形成结晶后其溶解度和原来在混杂状态下不同，有时需要采用两种不同的溶剂分别重结晶才能得到纯粹的结晶，即在甲溶剂中重结晶以除去杂质后，再用乙溶剂重结晶以除去另外的杂质。结晶和重结晶 （4）结晶制备方法：结晶形成过程包括晶核的形成与结晶的增长两步骤。通常将化合物溶于适当溶剂中，过滤、浓缩至适当体积后，塞紧瓶塞，静置。如果放置一段时间后没有结晶析出，可松动瓶塞，使溶剂自动挥发，可望得到结晶，或可加入少量晶种，加晶种是诱导晶核形成的有效手段。结晶和重结晶 （5）难结晶和非结晶化合物的处理化合物不易结晶，其原因一种是本身的性质所决定，另—种在很大程度上是由于纯度不够，夹杂不纯物引起的。若是后者就需要进一步分离纯化，若是本身的性质，则就需要制备结晶性的衍生物或盐，然后用化学方法处理回复到原来的化合物，达到分理纯化的目的。结晶和重结晶 （6）结晶纯度判断结晶的形状很多，常见为针状、柱状、棱柱状、板状、片状、方晶、粒状、簇状及多边形棱柱状晶体等，结晶形状随结晶的条件不同而异。每种化合物的结晶都有一定的形状、色泽和熔点，可以作为初步鉴定的依据，而非结晶物质则不具备上述物理性质。结晶和重结晶 （6）结晶纯度判断纯结晶性化合物部有一定的晶形和均匀的色泽，通常在同一种溶剂下结晶形状是一致的。单纯化合物结晶的熔点熔距应在0.5℃左右，但由于晶体结构的原因可允许在1～2℃内。熔点测定仪 结晶和重结晶 （6）结晶纯度判断经典方法判断化合物的纯度是比较复结晶前后结晶的形状和熔点，纯化合物重结晶前后的熔点应该一致，如果熔距较长表示化合物不纯。但是也有例外，特别是当有些化合物只有分解点，而熔点不明显的情况下，会出现较长的熔距。结晶和重结晶 （6）结晶纯度判断另外要注意有些化合物具有双熔点的特性。即在某一温度已全部熔化，继续升高温度时又固化，再在某一更高温度时又熔化或分解。与糖结合的甙类化合物具有此性质。最简便的纯度检查方法是薄层层析法。通常用数种展开溶剂系统呈现为一个斑点者(比移值在0.3～0.7之间)，可认为是单纯的化合物。结晶和重结晶 （6）结晶纯度判断液体的纯度以它的沸点来确定，纯化合物的沸距应在1℃范围内。气相层析是一种高灵敏度判断纯度的方法，主要适用于在加热条件下能气化而不分解的物质，如挥发油类。高效液相层析是近年用来判断成分纯度的一种重要手段。2.4层析技术的基本原理层析技术是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的差异，使它们在某种基质中移动速度不同而实现分离纯化的方法。原理：所有的层析系统都由两个相组成：一是固定相或称支持剂，它是由层析基质组成的，它可以是固体物质（如吸附剂、凝胶和离子交换剂等）或液体物质（如固定在纤维素或硅胶上的溶液），这些物质与相关化合物进行可逆的吸附、溶解和交换作用；另一相是流动相，即推动固定相上的物质向一定方向移动的液体、气体或超临界流体，柱层析时称之为洗脱剂，薄层层析时称之为展开剂。当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组分的性质如溶解度、吸附能力、立体化学特性、分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力和特异的生物学反应等方面存在差异，与两相发生相互作用的能力不同，随着流动相向前移动，各组分不断地在两相中进行再分配。与固定相相互作用力越弱的组分，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快；与固定相相互作用越强的组分，向前移动速度越慢。分步收集流出液，可得到样品中所含的各单一组分，从而达到将各组分分离的目的。（1）根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。层析技术的分类：纸层析是指以滤纸作为基质的层析。薄层层析是将基质在玻璃或塑料等光滑表面铺成一薄层，在薄层上进行层析。柱层析则是指将基质填入管中形成柱形，在柱中进行层析。层析技术的分类：纸层析和薄层层析主要适用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常为一次性使用；柱层析是常用的层析形式，适用于样品分离纯化与分析。层析技术的分类：（2）根据流动相的形式分类，层析可以分为液相层析和气相层析。流动相为气体的称为气相层析，而流动相为液体的称为液相层析。层析技术的分类：气相层析具有微量快速的特点，但要求样品能气化和热稳定性高，大大限制了其应用；而液相层析是生物领域最常用的层析形式，特别是高效液相色谱的诞生更是为分离纯化天然产物注入了活力。层析技术的分类：（3）根据分离的原理不同分类，层析主要可以分为吸附层析、分配层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。层析技术的分类：液－固层析（Liquid-SolidChromatography）液相层析（LiquidChromatography）液－液层析（Liquid-LiquidChromatography）层析技术的分类：气－固层析（Gas-solidChromatography）气相层析（GasChromatography）气－液层析（Gas-liquidChromatography）层析技术的分类：液固吸附层析（Liquid-solidAdsorptionChromatography）吸附层析（AdsorptionChromatography）气固吸附层析（Gas-solidAdsorptionChromatography）层析技术的分类：液液分配层析（Liquid-liquidPartitionChromatography）分配层析（PartitionChromatography）气液分配层析（Gas-liquidPartitionChromatography）层析技术的分类：液固排阻层析（Liquid-solidExclusionChromatography）排阻层析（ExclusionChromatography）气固排阻层析（Gas-solidExclusionChromatography）层析技术的分类：有机离子交换树脂（OrganicResinousMaterial）离子交换层析（IonExchangeChromatography）纤维素及无机离子交换剂（CellulosicInorganicResinousMaterial）层析技术的分类：层析硅胶为一多孔性物质，可用通式SiO2.xH2O表示,它具有多孔性的硅氧环Siloxane）－Si－O－Si－的交键结构。由于其骨架表面具有很多游离(I)、键合(II)和键合－活性(III)状态的硅醇基(Silanol)基团,它能够通过氢键与极性或不饱和分子相互作用，同时能吸附多余的水分。硅胶柱层析硅胶具有弱的非特异性吸附，能同样吸附极性、非极性饱和和不饱和分子，所以硅胶具有吸附层析与分配层析的双重性。硅胶柱层析硅胶的吸附性能取决于硅胶中硅羟基的数目，其次是含水量，它随着水分的增加而降低。若吸水量超过12％，吸附力极弱，不能用作吸附层析，只可用作分配层析的载体。硅胶的表面积、表面结构、微孔体积及微孔半径均直接影响着层析分离的效果。硅胶柱层析同时硅胶又是一种弱酸，其表面的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，解离常数为10－6～10－8，是一种弱酸性阳离子交换剂，当遇到较强的碱性化合物时，则可因离子交换作用而吸附碱性化合物。硅胶柱层析硅胶表面的硅羟基能与各种醇如氰乙醇、正辛醇、聚乙二醇在一定温度下加热脱水后生成单分子键合固定相(Si－O－C型)，与十八烷基三氯硅烷生成烷基化学键合相(Si－O一Si－C型)。硅胶柱层析另外用SOCl2将硅胶表面氯化后，与各种有机胺反应生成具Si－O－Si≡N键的各种不同极性基团的化学键合相，这大大有助于提高分离选择，在液相色谱中占有极为重要的地位，并普遍用于高效液相层析。硅胶柱层析硅胶柱制备分为干法和湿法两种。选用合适尺寸的层析柱，洗净待用；层析柱下口处均匀塞上合适量的脱脂棉，不可过多以免堵塞柱子，也不可太少，以免硅胶流失，尽量将脱脂棉平铺在流出口处；现在可供选择的层析柱多自带石英沙层，不用再用脱脂棉处理，使用比较方便。层析柱的制备：湿法制备层析柱：溶胀活化后硅胶；预装溶剂；倾入硅胶、沉降。层析柱的制备：干法制备层析柱：直接沉降活化后硅胶；倾入溶剂、充分溶胀。层析柱的制备：层析过程中溶剂的选择，是影响层析分离效果的一个重要因素。通常是根据物质的极性度采用相应的极性溶剂来洗脱，在实际吸附层析中是采用从低极性逐步递增极性的梯度洗脱方式。溶剂的洗脱力随介电常数(表1)增高而加大。层析溶剂的选择：层析溶剂的选择：常用溶剂的介电常数（ε）洗脱能力己烷1.88苯2.29无水4.47氯仿5.20乙酸乙酯6.11丙酮21.5乙醇26.0甲醇31.2水81.0一般在柱层析之前，都会借助薄层层析，选择确定分离纯化所用的洗脱剂。薄层层析的结果来摸索到分离条件，基本上可以用于柱层析，两者所不同者在于样品与硅胶的用量比例，故通常柱层析所用的溶剂比薄层层析展开剂极性略偏小。层析溶剂的选择：湿法加样：当样品能够溶解在少量的洗脱剂（或者第一个洗脱剂系统）中时，可以采用湿法上样的方法。加样：湿法加样：将样品溶于尽量少的洗脱剂中直至澄清，用滴管将样品液加在上层硅胶面（或者石英层）表层。使样品液逐渐渗透入硅胶柱中，注意用尽量少的溶液溶解样品，尽可能保留加样色带狭，再进行展开，避免样品层过度扩散。加样：干法加样：如果样品很难溶于洗脱剂，则要选用干法上样的方式。用能够溶解样品的溶剂，和干燥的硅胶充分搅拌混散均匀。待溶剂完全挥发干后，上柱，然后再用洗脱剂展开。加样：氧化铝层析是最常用的层析方法之一，适用于亲酯性成分分离。广泛应用于生物碱、甾体化合物、强心甙、精油、内酯化合物等有效成分的分离。它具有价廉、分离效果好、再生容易、活性容易控制而能适应不同化合物层析要求等优点。氧化铝层析氧化铝可能带有碱性（因其中可混有碳酸钠等成分），对于分离一些碱性中草药成分，如生物碱类的分离颇为理想。但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离。因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应，如异构化、氧化、消除反应等。氧化铝层析中性氧化铝仍属于碱性吸附剂的范畴，不适用于酸性成分的分离。用稀硝酸或稀盐酸处理氧化铝，不仅可中和氧化铝中含有的碱性杂质，并可使氧化铝颗粒表面带有NO3—或CI—的阴离子，从而具有离于交换剂的性质，适合于酸性成分的层析，这种氧化铝称为酸性氧化铝。氧化铝层析供层析用的氧化铝，用于柱层析的，其粒度要求在100～160目之间。粒度大子100目，分离效果差：小于160目，溶浓流速大慢，易使谱带扩散。氧化铝层析样品与氧化铝的用量比，一般在1：20～50之间层析柱的内径与柱长比例在1：10-20之内。在用溶剂冲洗柱时，流速不宜过快，洗脱液的流速一般以每0.5h～1h内流出液体的毫升数与所用吸附剂的重量（克）相等为合适。氧化铝层析固定层析柱；溶胀氧化铝；加入预溶剂；倾入氧化铝；充分沉降。氧化铝柱的制备：聚酰胺(Polyamide)是通过酰胺基聚合而成的一类高分子化合物，商品名：锦纶、尼龙。分子中含有丰富的酰胺基，可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形式氢键结合而被吸附，不能形成氢键的化合物分离。聚酰胺层析聚酰胺对黄酮体、酚类、醌类等物质的分离，远比其他方法优越。对黄酮体等物质的层析是可逆的，分离效果高，可使性质极相近的类似物得到分离。聚酰胺柱层析的样品容量大，适于制备分离。聚酰胺层析化合物分子中酚羟基数目越多，则吸附力越强，芳香核、共轭双键多的吸附力也大。易形成分子内氢键的化合物，会使化合物的吸附力减少，从聚酰胺柱上洗脱被吸附的化合物是通过一种溶剂分子取代酚性化合物来完成的，也就是说以一种新的氢键代替原有氢键的脱吸附而完成的(如下式)。聚酰胺层析原理：聚酰胺层析原理：当用极性移动相(如含水溶剂系统)时，聚酰胺作为非极性固定相，其层析行径类似于反相分配层析。因黄酮体甙的的极性比其甙元的极性大，所以黄酮体甙比甙元容易洗脱；聚酰胺层析原理：当用非极性移动相(如：氯仿－甲醇)时，聚酰胺则作为极性固定相，其层析行径类似正相分配层析。因黄酮体甙元的极性比其甙小，所以甙元比其甙容易洗脱。这表明聚酰胺具有“双重层析”的性能。聚酰胺层析原理：层析中常用的聚酰胺足由己内酰胺聚合而成的尼龙－6，及由己二酸与己二胺聚合而成的尼龙－66。既亲水又亲脂，性能比较好，可分离水溶形物质，又可分离脂溶性物质。聚酰胺的性质：它可溶于浓盐酸、甲酸，微溶于乙酸、苯酚等溶剂，不溶于水、甲醇、乙醇、丙酮、、氯仿和苯等常用有机试剂，对碱较稳定。对酸的稳定性较差，尤其是无机酸，温度高时更敏感。聚酰胺的性质：制备柱时是将颗粒状聚酰胺混悬于水中湿法装柱，在用非极性溶剂系统层析时，则用组分中低极性的溶剂装柱。聚酰胺层析的操作：样品一般每100mL聚酰胺可上样1.5～2.5g，其比例视具体情况而定。样品先用洗脱剂溶解，浓度约20％～30％。若不溶解于洗脱剂，可以选用易挥发的有机溶剂溶解，拌入干粉中后将溶剂减压蒸去，湿法装入柱顶。聚酰胺层析的操作：洗脱剂常采用水递增乙醇至浓乙醇液或者氯仿、氯仿－甲醇系统递增甲醇至纯甲醇洗脱。若仍有物质未洗脱下来，可采用稀氨水或稀甲酰胺溶液洗脱，分段收集，以聚酰胺薄膜检验样品成分，合并相同组分。聚酰胺层析的操作：使用过的聚酰胺一般用5％NaOH洗涤，然后水洗再用10％醋酸洗涤，最后用蒸馏水洗至中性。可重复多次使用。聚酰胺层析的操作：聚酰胺薄膜层析是将聚酰胺溶于甲酸中涂布在绦纶片基上所制成的膜片，待甲酸挥发干燥后即可使用。聚酰胺薄膜可用作聚酰胺柱层析分离溶剂系统摸索的依据，又可检查柱层析各流分的成分和纯度。聚酰胺薄膜层析：大孔吸附树脂是一种不含交换基团的、只有大孔结构的高分子吸附剂，也是一种亲脂性物质。它可以有效地吸附具有不同化学性质的各种类型化合物。大孔吸附树脂层析以范德华力从很低浓度的溶液中吸附有机物。构成它的一个重要方面是因为它具有各种不同的表面性质，譬如疏水性的聚苯乙烯，能将低极性有机化合物吸附，主要依靠分子中的亲脂键、偶极离子及氢键的作用，这种吸附力的特点是解吸容易。大孔吸附树脂层析当吸附过程是以亲脂键为主时，随着被吸附物的分子量加大，吸附量也随着增加。吸附剂的表面积愈大，吸附量愈高。通常大孔吸附树脂的比表面可达100～600m2/g。大孔吸附树脂层析大孔吸附树脂包含有许多具有微观小球的网状孔穴结构，颗粒的总表面积很大，具有一定的极性基团，使大孔树脂具有较大的吸附能力；大孔吸附树脂层析另一方面，这些网状孔穴的孔径有一定的范围，使得它们对通过孔径的化合物根据其分子量的不同而具有一定的选择性。通过吸附性和分子筛原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而达到分离的目的。大孔吸附树脂层析大孔吸附树脂一般为白色球形颗粒，通常分为极性和非极性两类。由于具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点。大孔吸附树脂的性质：大孔吸附树脂不溶于酸、碱及有机溶剂中，所以在天然化合物的分离纯化中被广泛应用，如苷类、生物碱、黄酮、三萜类化合物的分离方面。对有机物选择性好，不受无机盐等离子和低分子化合物的影响，尤其在分离海洋微生物发酵液中的活性物质除盐过程中，应用的比较广泛。大孔吸附树脂的性质：大孔吸附树脂不溶于酸、碱及有机溶剂中，所以在天然化合物的分离纯化中被广泛应用，如苷类、生物碱、黄酮、三萜类化合物的分离方面。对有机物选择性好，不受无机盐等离子和低分子化合物的影响，尤其在分离海洋微生物发酵液中的活性物质除盐过程中，应用的比较广泛。大孔吸附树脂的性质：以乙醇湿法装柱，继续用乙醇在柱上流动清洗，不时检查流出的乙醇，至与水混合不呈白色混浊为止(取1mL乙醇液加5mL水)。然后以大量的蒸馏水洗去乙醇，备用。少量乙醇存在将会大大降低树脂的吸附力。大孔树脂柱的制备：大孔吸附树脂适用于从水溶液中分离低极性或非极性化合物，组分间极性差别越大，分离效果越好。混合组分在大孔树脂吸附后，一般依次用水、含水甲醇、乙醇成乙酮10％，20％……(V/V)洗脱，最后用浓醇或丙酮洗脱。层析溶剂的选用：市售大孔吸附树脂，用乙醇加热回流洗脱(或用改良索氏提取器加热洗脱)，洗至洗脱液蒸干后无残留物。经乙醇洗净的树脂挥去溶剂后保存备用。 大孔树脂的预处理：经反复使用后，吸附树脂颜色变深，吸附效果下降时，可用0.01%～1mol/LNaOH(或HCl)洗涤或浸泡适当时间，至树脂接近原颜色为宜，继用蒸馏水洗至中性即可再用。 大孔树脂的再生：活性炭层析是分离水溶件物质的主要方法之一，一些甙类、糖类及氨基酸等成分具有较好的分离效果。其特点是：来源容易、价格便宜，样品上柱量大，因此适用于大量制备性分离。活性炭层析粉末状活性炭，该类活性炭颗粒极细、呈粉末状，总表面积大、吸附力强、流速慢，层析过程中需要加压或减压操作，难以达到理想的流速。活性炭层析颗粒状活性炭，颗拉较大，虽然总表面积减少，但流速易于控制。以锦纶为粘合剂,将粉末活性炭制成颗粒,比表面积介于粉末活性炭和颗粒活性炭之间，吸附能力较两者弱。活性炭层析活性炭的吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中较弱，故用有机溶剂脱吸附。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于对脂肪族化合物，因此可以借此性质将芳香族氨基酸和肪族氨基酸(两者的氨基和羟基总数相同)分开，也可将某些水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开。活性炭层析对分子量大化合物的吸附力大于对小分子量的化合物；因此可以利用这个性质将肽－氨基酸、多糖－单糖分离开来，氨基酸和单糖先洗脱下来，肽和多糖后洗脱下来。活性炭层析对极性基团(如－COOH，－NH2，－OH等)多的化各物的吸附力大于对极性基团少的化合物。因此可以利用这些吸附性能的差别，将碱性氨基酸、中性氨基酸和酸性氨基酸分离开。活性炭层析使用前先应将活性炭于120℃加热4～5h，使所吸附的气体除去。使用过的活性炭可用稀酸、稀碱交替处理、然后水洗，加热活化。有时将粉末状活性炭制成颗粒状锦纶活性炭(1：2)或与硅藻土(1：1)混合后装柱，以增加流速，但颗粒状活性炭吸附性能力比粉末状活性炭低。活性炭预处理：活性碳层析在操作时，先将活性碳在水中浸泡1h，搅拌除去气泡，在柱中预先装入少量蒸馏水，将处理过的活性炭倒入柱中，使其自然沉降。活性炭层析操作：样品用水溶解控制样品浓度在25～50％之间，活性炭与样品量的比例大概为100：5（10）。具体样品浓度和上样量视情况而定。当样品在水中不能完全溶解的时候，可加适量的甲醇、乙醇或者丙酮。但要减样品的上样量，体积也不能太大。活性炭层析操作：洗脱溶剂一般采用水、各种浓度的乙醇液。最常用的是水、由稀至浓的乙醇水溶液梯度洗脱。其洗脱顺序是水、10％、20％、30％、50％、70％的乙醇溶被。活性炭层析操作：若仍有部分物质质未洗脱下来，最后可用适当有机溶剂或3.5％的氨水洗脱。活性炭层析也可采用5～10％的丙酮液、2～5％醋酸、1～5％苯酚水溶液等洗脱，但不常用。活性炭层析操作：离子交换层析（IonExchangeChromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据交换剂中的平衡离子与流动相中的组分离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析离子交换剂包括基质、电荷基团和平衡离子三部分。离子交换剂的基质是一类不溶于水的惰性高分子聚合物，如树脂、纤维素等；电荷基团与基质以共价键结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团；离子交换剂：平衡离子则是结合于电荷基团上的反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。离子交换剂：平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂（以R－X-Y+表示，R、X和Y分别代表基质、电荷基团和平衡离子）；离子交换剂：平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂（可以R－X+Y-表示）。离子交换剂：阴阳离子交换剂与溶液中的离子A的交换作用可表示为：R－X-Y++A+←→R－X-A++Y+或R－X+Y-+A-←→R－X+A-+Y-离子交换剂：阳离子交换树脂中的解离性基团是磺酸（－SO3H）、磷酸（－PO3H2）、羧酸（－COOH）和酚性羟基（－OH）等酸性基团。阴离子交换树脂中的解离性基团含有季胺、伯、仲、叔胺等碱性基团。各类树脂，根据解离性能大小还分为强、中、弱等。离子交换剂的分类：强酸性－SO3H阳离子交换树脂弱酸性－COOH－PO3H2离子交换剂的分类：强碱性－N－（CH2）3X－N－（CH2）2XC2H4OH阴离子交换树脂弱碱性NR2NHRNH3离子交换剂的分类：离子交换剂根据与基质的组成和性质还可分为两大类：一类是疏水性离子交换剂，该类离子交换剂的基质是一种人工合成的、与水结合力较小的树脂，常用的一类树脂是苯乙烯和苯二乙烯的聚合物。离子交换剂的分类：树脂型离子交换树脂一般为网状结构的珠状体，其特点是机械强度大、流速快、与水的亲和力较小且容易引起蛋白的变性，故一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。离子交换剂的分类：另一类是以纤维素、交联纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖等为基质的亲水性离子交换剂，适合于分离蛋白质等大分子物质。离子交换剂的分类：A溶液的酸碱度当交换溶液中氢离子的浓度显著增大时，因同离子效应抑制了阳离子交换剂中的酸性基团的解离，故离子交换反应就很少进行，甚至不进行。影响离子交换的因素：A溶液的酸碱度通常强酸性交换剂交换液的pH应大于2，弱酸性交换剂的交换液pH应在6以上。同样在阴离子交换剂中，当溶液的pH值增大时，亦会发生同样的情况，故强碱性交换剂的交换液的pH应在12以下，弱碱性应在7以下。影响离子交换的因素：B对交换离子的选择性离子交换剂对交换化合物来说，主要取决于化合物的解离离子的电荷、半径及酸碱性的强弱。解离常数大，酸碱性强者容易置换，但洗脱相对来说较难。解离离子价数越高，电荷愈大，它的吸附性愈强。越易交换在交换树脂上。影响离子交换的因素：B对交换离子的选择性碱金属、碱土金属及稀土元索还与它们的原子序数有关，前者原子序数大则交换吸附就强，稀土元索的原子序数小，其交换吸附弱。影响离子交换的因素：B待分离的化合物离子交换操作通常是在水溶浓或含有水的极性溶剂中进行，这样有利于解离与交换。浓度低的溶液对离子交换剂的选择性大，在高浓度时解离度会趋向减少，有时会影响吸附次序及选择性；影响离子交换的因素：B待分离的化合物浓度过高时，亦会引起树脂表面及内部交联网孔收缩，影响离子进人网孔，所以一般实验操作时，所用的溶液的浓度应略高，有利于提取分离。影响离子交换的因素：C温度稀溶液温度的改变对交换的性能影响不大，仅在0.1N以上浓度时，温度升高对水合倾向大的离子容易交换吸附，同时离子的活性系数增大。影响离子交换的因素：C温度对弱酸、弱碱交换剂来说，其交换率有较大的影响。一般温度增高，离子交换速度加快，在洗脱时亦可提高洗脱能力。但对不耐热的交换剂应注意操高温度的条件，避免引起交换剂的破坏。影响离子交换的因素：此外，交换树脂本身的交联度、交联网径的直径、树脂颗粒的大小、溶液的极性也是影响离子交换的因素。影响离子交换的因素：层析柱的制备：把树脂放在烧杯中，加水充分搅拌，将气泡全部赶掉。放置几分钟使大部分树脂沉降，倾去上面的泥状微粒，反复上述操作到上层液透明为止。粒度小的树脂，搅拌后要放置久一些。将处理好的树脂，加少量水搅拌后加入离子交换层析柱，同时打开阀门，使水流出，树脂自然沉降。离子交换层析的操作：上样：离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和pH值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的1－5％为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分离效果。离子交换层析的操作：阴离子交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，将结合在离子交换剂上的各种负电基团逐步置换出来，随洗脱液流出。离子交换层析的过程：离子交换层析的过程：通过离子强度梯度洗脱，与离子交换剂结合力最弱的负电基团先被置换出来，随着洗脱液离子强度的增加，各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来，从而达到分离目的。离子交换层析的过程：凝胶过滤层析（GelFiltrationChromatography），也称分子筛层析（MolecularSieveChromatography）、尺寸排阻层析（SizeExclusionChromatography）或凝胶渗透层析（GelPermeationChromatography）等。凝胶层析它是以多孔性凝胶填料为固定相，利用流动相中所含各物质的相对分子质量不同而分离的一种层析技术。由于凝胶过滤具有设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高等优点。因此，此法广泛应用于分离纯化海洋天然产物。凝胶层析凝胶层析的原理：凝胶层析：凝胶的种类：凝胶的种类很多，分离纯化海洋天然小分子化合物常用的凝胶主要有葡聚糖凝胶（Dextran）以及羟丙基葡聚糖凝胶。凝胶的种类：葡聚糖凝胶中最常见的是Sephadex系列，它是葡聚糖与3－氯－1,2环氧丙烷（交联剂）相互交联而成。Sephadex的主要型号是G－10～G－200，数字越大的，吸水率越大，排阻极限越大，分离范围也越大。凝胶的种类：在SephadexG－25和G－50加入羟丙基即可构成烷基化葡聚糖凝胶，主要型号为SephadexLH－20和LH－60。与SephadexG系列仅具亲水性不同，LH－20和LH－60不仅保留了G－25和G－50原有的分子筛特性，可按分子大小分离物质外，也可以有机溶剂为流动相分离脂溶性物质，例如胆固醇、脂肪酸、激素等。凝胶柱的制备和操作：用于凝胶层析的层析柱，一般柱长度不超过100cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1：25～1：100之间。凝胶柱的制备和操作：凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1～2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液。将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升直到所需高度为止。凝胶柱的制备和操作：平衡凝胶床过夜使用前，要检查层析床是否均匀、有无纹路或气泡或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄均匀平整，说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲散乱、变宽时，必须重新装柱。凝胶柱的制备和操作：凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5%－10%(质量分数)，样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5～2。凝胶柱的制备和操作：样品加入后，打开流出口使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液洗管壁，使其全部进入凝胶床。将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连预先设计好流速，然后分部收集洗脱液并对每一流份做定性定量测定。凝胶柱的制备和操作：一般方法是：将凝胶用水冲洗干净，滤干，依次用70%、90%、95%乙醇脱水平衡，至乙醇浓度达90%以上，滤干再用洗去乙醇，滤干，干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。凝胶的回收：凝胶可以重复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌可在一次层析后加入0.02%的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去以免干扰洗脱液的测定。凝胶的保存：薄层层析即薄层色谱法(ThinLayerChromatography)常用TLC表示，是将适宜的固定相涂布于玻璃板上，成一均匀薄层，等点样、展开后，与适宜的对照物按同法所得的色谱图作对比，用以进行药品的鉴别，杂质检查或含量测定的方法，属于固－液吸附色谱。薄层层析薄层层析是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。即适用于小量样品的分离又可分离多达500mg的样品。薄层层析玻板：除另有规定外，用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的规格，要求光滑，平整、洗净后的不附水珠，晾干。薄层层析的仪器和材料：固定相或载体：最常用的有硅胶G、硅胶GF、硅胶H、硅胶HF254，其次有硅藻土、硅藻土G、氧化铝、氧化铝G、微晶纤维素、微晶纤维素F254等。其颗粒大小，一般要求直径为10～40μm。薄层层析的仪器和材料：粘合剂：薄层涂布，一般可分无粘合剂和含粘合剂两种；前者系将固定相直接涂布于玻璃板上，后者系在固定相中加入一定量的粘合剂。一般常用10－15%煅石膏（CaSO4·2H2O在140℃烘4小时），混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液（0.5－0.7%）适量调成糊状，均匀涂布于玻璃板上。薄层层析的仪器和材料：涂布器：应能使固定相或载体在玻璃板上涂成一层符合厚度要求的均匀薄层。点样器：常用具支架的微量注射器或定时毛细管，应能使点样位置正确集中。展开室：应使用适合薄层板大小的玻璃制薄层色谱展开缸，并有严密盖子，除另有规定外，底部应平整光滑，应便于观察。薄层层析的仪器和材料：将1份固定相和3份水在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的泡后，倒入涂布器中，在玻璃板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.2～0.3mm），取下涂好薄层的玻璃板，置水平台上于室温下晾干，后在110℃烘30分钟。即置有干燥剂的干燥箱中备用。薄层层析板的制备：用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线cm，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。薄层层析点样：预饱和：展开室如需预先用展开剂饱和，可在室中加入足够量的展开剂，并在壁上贴二条与室一样高、宽的滤纸条，一端浸入展开剂中，密封室顶的盖，使系统平衡或按正文规定操作。薄层层析的展开：将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5～1.0cm（切勿将样点浸入展开剂中），密封室盖，等展开至规定距离（一般为10～15cm），取出薄层板，晾干，干燥后喷以显色剂，或在紫外灯下显色。记下原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值（Rf），也可用薄层扫描法，定量分析。薄层层析的展开：薄层层析的展开：干柱层析属于液－固层析的范畴，是指用填充剂干装成柱，进行柱层析分离的方法。干柱层析有塑料膜柱和玻璃柱两类，塑料常为聚乙烯薄膜。干柱层析干柱层析已经广泛用于实验室制备性分离。其优点是：分离效率高，分离条件可用薄层摸索，如果直接套用薄层最佳的分离条件，即可得到与薄层基本相同的分离效果。干柱层析干柱层析是将干吸附剂（未与洗脱剂混合）装柱，设法将样品加到上面，从柱项加入洗脱剂，使洗脱剂往下移动至柱底，使待分离的成分层析、展开。这种层析方法实际上是将制备薄层层析的一种改进，薄层改为柱状，采用塑料薄膜柱，可展层后切割，分别处理所分离的成分，其原理同薄层层析。干柱层析由于填充剂是干燥状态填装柱，内中充满空气，故在展层过程中溶剂和样品较湿，较难进入颗粒深孔内，这样在一定程度上克服了化合物分子进出填充剂颗粒深孔所造成的涡流扩散和传质速率缓慢，因而提高了柱效。干柱层析一般所用柱的高度不宜超过50cm，直径在1～3cm之间。主要决定样品容量及吸附剂量，通常比例在1：100以上。干柱层析高效液相色谱法(HPLC)是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相色谱法。高效液相层析液－固吸附层析：固定相是具有吸附活性的吸附剂，常用的有硅胶、氧化铝、高分子有机酸或聚酰胺凝胶等。流动相依其所起的作用不同，分为“底剂”和洗脱剂两类，底剂起决定基本色谱的分离作用，洗脱剂起调节试样组份的滞留时间长短，并对试样中某几个组份具有选择性作用。HPLC的分类：根据固定相与流动相极性的不同，液－液色谱法可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。HPLC的分类：液－液分配层析：固定相为单体固定液构成。将固定液的官能团结合在薄壳或多孔型硅胶上，经酸洗、中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羟基。这种以化学键合相为固定相的液－液层析称为化学键合相层析。另一种利用离子对原理的液－液分配层析为离子对层析。HPLC的分类：①极性键合相层析：固定相为极性基团，氰基、氨基及双羟基三种。流动相为非极性或极性较小的溶剂。极性小的组份先出峰，极性大的后出峰，这称为正相层析法，适用于分离极性化合物。化学键合层析：②非极性键合相层析：固定相为非极性基团，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基与苯基等，流动相用强极性溶剂，如水、醇、乙腈或无机盐缓冲液。极性大的组份先出峰，极性小的组份后出峰，恰好与正相法相反，故称反相层析。化学键合层析：②非极性键合相层析：流动相最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶剂，水不仅起洗脱作用还可掩盖载体表面的硅羟基，防止因吸附而至的拖尾现象。本法适用于小分子物质的分离，如肽、核苷酸、糖类、氨基酸的衍生物等。化学键合层析：①正相离子对层析：此法常以水吸附在硅胶上作为固定相，把与分离组份带相反电荷的配对离子以一定浓度溶于水或缓冲液涂渍在硅胶上。流动相为极性较低的有机溶剂。在层析过程中，待分离的离子与水相中配对离子形成中性离子对，在水相和有机相中进行分配，而达到分离。本法优点是流动相选择余地大，缺点是固定相易流失。离子对分配层析：②反向离子对层析：固定相是疏水性键合硅胶，如C18键合相，待分离离子和带相反电荷的配对离子同时存在于强极性的流动相中，生成的中性离子对在流动相和键合相之间进行分配，而得到分离。本法优点是固定相不存在流失问题、流动相含水或缓冲液更适用于电离性化合物的分离。离子对分配层析：离子交换层析：原理与普通离子交换相同。在离子交换HPLC中，固定相多用离子性键合相，故本法又称离子性键合相层析。流动相主要是水溶液，pH值最好在被分离酸、碱的pK值附近。离子交换层析：1、高压输液系统：高压输液系统由溶剂贮存器、高压泵、梯度洗脱装置和压力表等组成。HPLC系统的组成：①溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。高压输液泵是高效液相色谱仪中关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。HPLC系统的组成：②对泵的要求：输出压力高、流量范围大、流量恒定、无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右。此外，还应耐腐蚀，密封性好。高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相粘度和柱渗透无关。恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。HPLC系统的组成：③梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。HPLC系统的组成：③梯度洗脱装置分为两类：一类是外梯度装置（又称低压梯度），流动相在常温常压下混合，用高压泵压至柱系统，仅需一台泵即可。另一类是内梯度装置（又称高压梯度），将两种溶剂分别用泵增压后，按电器部件设置的程序，注入梯度混合室混合，再输至柱系统。HPLC系统的组成：2、进样系统：进样系统包括进样口、注射器和进样阀等，它的作用是把分析试样有效地送入色谱柱上进行分离。HPLC系统的组成：3、分离系统：分离系统包括色谱柱、恒温器和连接管等部件。色谱柱一般用内部抛光的不锈钢制成。其内径为2～6mm，柱长为10～50cm，柱形多为直形，内部充满微粒固定相。柱温一般为室温或接近室温。HPLC系统的组成：4、检测器：检测器是液相色谱仪的关键部件之一。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等。HPLC系统的组成：检测器：在液相色谱中，有两种类型的检测器，一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或物理化学特性有响应。属于此类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等；另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理和化学性质响应。属于此类检测器有示差折光检测器等。HPLC系统的组成：HPLC系统的组成：高效液相层析（HPLC）示意图一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。HPLC流动相的选择：①流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。HPLC流动相的选择：②纯度：色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。因此，溶剂系统在使用前都必须过滤。 HPLC流动相的选择：③必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。HPLC流动相的选择：④粘度要低。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点在100℃以下的流动相。HPLC流动相的选择：⑤对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。 ⑥样品易于回收。应选用挥发性溶剂。HPLC流动相的选择：正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。HPLC流动相的选择：一般情况下，甲醇－水系统已能满足多数样品的分离要求，且流动相粘度小、价格低，是反相色谱最常用的流动相。但初始实验推荐采用乙腈－水系统，因为与甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外185～205nm处检测的要求，因此，综合来看，乙腈－水系统要优。 HPLC流动相的选择：逆流色谱技术（CounterCurrentChromatigraphy，CCC）是当今国际分离技术的一个新颖的分支。它的突出特点是用很长的软管（如聚四氟乙烯管）绕制成的色谱柱内不加入任何固态支撑体或填料。逆流色谱层析选择某一种有机/水两相溶剂体系或双水相溶剂体系，此体系可以是二元的或多元的。用此体系的上层或下层作为色谱过程的固定相，首先将其注满管柱内，然后让此管柱作特定的旋转运动，用由此形成的离心力场来支撑住柱内的液态相。逆流色谱层析用溶剂体系中的另一层作为流动相，带着混合样品由泵的压力推入分离管柱，样品就会穿过两个液相对流的整个管柱空间，各个组分也就会按其在两相中的分配系数(即某一化学组分在流动相中的溶解度同它在固定相中的溶液解度的比值)分离开来。逆流色谱层析①逆流色谱不用固态支撑体，完全排除了支撑体对样品组分的吸附、沾染、变性、失活等不良影响。所以，能避免不可逆吸附所造成的溶质色谱峰拖尾现象能实现很高的回收率。逆流色谱的特点：②逆流色谱的分配分离是在旋转运动中完成的，两相溶剂都被剧烈振动的离心力场依其界面特征见成极微小的颗粒，样品各组分会在两相微粒的极大表面上分配，并且能在颗粒振荡与对流的环境中有效地传递。所以，它就像是把通常的溶剂萃取过程成千上万次地、高效地、自动连续地予以完成。逆流色谱的特点： ③没有填料在柱内的占空体积，逆流色谱的分离柱又容易做得容积大些，柱内空间全部是有效空面。所以，它的样品负载能力很强，制备量很大，而且重现性很好。逆流色谱的特点：  ④逆流色谱不用填料，分离过程不是淋洗或洗脱过程，而是对流穿透过程。所以，能节省昂贵的材料消耗和溶剂消耗，运行使用的后续投入较低。逆流色谱的特点： 逆流色谱的分离效率比不上气相色谱和高效液相色谱等技术，不适宜用它去完成组成复杂的混合物的全谱分离分析。而它对于样品预处理条件的放松，以及它的回收率高，制备量大的优点，作为特定部位和特定组分的分离纯化与制备则是十分可取的。逆流色谱的特点： ①液滴逆流色谱（DropletCounterCurrentChromatograph，DCCC）。这个仪器把一系列垂直的管子用毛细管连接起来。液体固定相留有直管中，把流动相慢慢的泵进去，（如果流动相比较重就从上方泵进去；反之，则从下方）。逆流色谱的分类： ②离心液滴逆流色谱（CentrifugalDCCC，CentrifugalPlanetaryChromatograph，CPC）。比DCCC进步的地方就是使用离心加快重力分离。逆流色谱的分类：③高速逆流色谱（High－SpeedCounterCurrentChromatography，HSCCC）。逆流色谱的分类：

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